xxxx年本科實驗四重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定(編輯修改稿)
2025-02-01 11:10 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ） 3. SDS堿裂解法提取 Puc119U6重組質(zhì)粒DNA 實驗原理： 高堿 細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放 ①染色體 DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈 DNA； ②線性雙鏈 DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。 ①質(zhì)粒 DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀； ②雙鏈 DNA并不完全分離。 高酸中和至中性 變性的染色體 DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物 質(zhì)粒 DNA又恢復天然構(gòu)型，溶解在上清液中 純化 RNA酶消化除去 RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì) 主要試劑及作用 溶液 Ⅰ ：由葡萄糖 、 EDTA、 Tris?HCl組成 .(保護 、 緩沖 ) ① 葡萄糖 的作用是增加溶液的粘度 ,減少抽提過程中的 機械 剪切作用 ,防止破壞質(zhì)粒 . (保護作用 ) ② EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子 , 防止 DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護作用） ③ Tris?HCl 能使溶菌液維持溶菌作用的最適 PH范圍（緩沖作用） 21 溶液 II： 由 SDS（ 十二烷基硫酸鈉 ） 與 NaOH 組成 (裂解 、 變性 ) ① SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之 變性（裂解細胞和蛋白質(zhì)變性作用） ② NaOH（ PH12）的作用是破壞氫鍵，使 DNA分子變性（ DNA變性作用） 22 溶液 III： HAC(乙酸 )和 KAC(乙酸鉀 )組成的高鹽溶液 (復性，分離 ) ① HAC溶液 能中和溶液 Ⅱ 的堿性，使染色體 DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒 DNA復性。 ② KAC會與 SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的 DNA也會與蛋白質(zhì) SDS 復合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒 DNA分離。 實 驗步驟 加 EP管， 12023rpm 1min，去上清， 再加 ， 12023rpm 1min，去上清 加入冰的 200 181。l 溶液 I， 劇烈振蕩 EP管，室溫放置 3min 加入 200181。l 溶液 II，快速顛倒數(shù)次，冰浴 3min （不要振蕩?。? 加入 150181。l 冰 溶液 III，溫和振蕩 10s，冰浴 5min， 12023rpm 5m
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