dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述(編輯修改稿)
2025-01-26 02:37 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 并有較強(qiáng)的啟動(dòng)子，因而是基因工程載體的理想候選者。諸如：SV40（猴腎病毒）EpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )牛乳頭瘤病毒（ BPV）昆蟲桿狀病毒（ baculovirus)v由于存在容量小、宿主范圍小等缺陷，天然SV40病毒作為載體很少被使用，多數(shù)載體為帶有來(lái)自 SV40中轉(zhuǎn)錄元件的質(zhì)粒型載體v SV40增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和復(fù)制子，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生高效的組成型表達(dá)。v SV40 polyA信號(hào)，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加工，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性。v Zeocin抗性基因，可作為大腸桿菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記。 Zeocin抗性基因在大腸桿菌中的合成由 EM7啟動(dòng)子控制，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)由 CMV啟動(dòng)子控制，既可用于瞬時(shí)表達(dá)，也可用于篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。v f1復(fù)制子，可產(chǎn)生單鏈 DNA。v ColE1復(fù)制起始位點(diǎn)，使質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制擴(kuò)增。EB病毒EB病毒vEpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )是人類皰疹病毒, 可轉(zhuǎn)化人的 B淋巴細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中以染色體外附加體形式存在。 EBV病毒的順式作用因子 oriP可以在帶有 EBV DNA并表達(dá)具有反式作用的 EBNA－ 1抗原的貼壁細(xì)胞中維持附加體DNA分子的存在，因而能作為構(gòu)建表達(dá)載體的元件，該類載體也主要用于建立帶有多拷貝外源基因的細(xì)胞系?？稍诙喾N細(xì)胞中表達(dá)，可表達(dá)基因組 DNA和 cDNA,可為表達(dá)細(xì)胞系。Comparison of different cloning vectors Vector type Length of cloned DNA Plasmid 20 kb Phage λ 25 kb Cosmid 45 kb P1 vector 100 kb BAC 100 Kb (bacterial artificial chromosome) YAC 1,000 kb (yeast artificial chromosome)DNA重組操作過(guò)程載體外源 DNA片段外源 DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞a b bA重組A b抗性篩選重組篩選一把特殊的剪刀 — 限制性內(nèi)切酶30多年前，當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體的宿主特異性的限制 修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種 “限制 ”病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源 DNA的限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點(diǎn)切開 DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。阿爾伯 (Arber)、史密斯 (Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲 1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來(lái)說(shuō)，它們可以小到如 PvuII（ 157個(gè)氨基酸），也可以比 1250個(gè)氨基酸的 CjeI更大除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)在已純化分類的 3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過(guò) 250種的特異識(shí)別序列。限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：A 用 3個(gè)字母代表來(lái)源的生物，如大腸桿菌 （ Escherichia coli）用 Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用 Hin表示。B 1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株（ EcoR、 Hind）C 1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序（ EcoRI、 Hind III ）限制性內(nèi)切酶的分類按照亞基組成、酶切位置、識(shí)別位點(diǎn)、輔助因子等因素限制性內(nèi)切酶可劃分為三大類：I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個(gè)亞基的蛋白復(fù)合體。其特點(diǎn)是識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，沒(méi)有固定切割位點(diǎn)。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割 DNA鏈，不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的電泳條帶，因而不具備實(shí)用性。III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制 修飾兩種功能的酶。雖然有特異切割位點(diǎn)，但它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開 DNA鏈，很少能產(chǎn)生確定的切割片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒(méi)有人將其商業(yè)化。II型限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開 DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三種 限制性內(nèi)切酶中 唯一用于 DNA分析和克隆的一類 。 II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來(lái)源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實(shí)際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過(guò)程中各自獨(dú)立產(chǎn)生的，而非來(lái)源于同一個(gè)祖先。II型限制性內(nèi)切酶中最普遍的是象 Hha I、 Hind III和Not I這樣在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到 DNA上，因而識(shí)別的是對(duì)稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識(shí)別非對(duì)稱序列。一些酶識(shí)別連續(xù)的序列（如 EcoR I識(shí)別 GAATTC）；而另一些識(shí)別不連續(xù)的序列（如 Bgl I識(shí)別 GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個(gè) 3‘羥基端和一個(gè) 5’磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應(yīng)的修飾酶則需要 S甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在 200300個(gè)氨基酸左右。
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