dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述-預(yù)覽頁
【正文】 Start codon (ATG): 24492451。 2. 中間 (JN間 ) 是 λ生長(zhǎng)非必需區(qū) , 可被其它外源 DNA取代 。 6. 篩選容易 —— 噬菌斑篩選 。 3. 多種單一的酶切位點(diǎn) .vcosmid較小 , 約 4 – 6kb , 可容納 4045kb的外源 DNA,由于 ?噬菌體 DNA包裝時(shí)包裝蛋白識(shí)別的只是 ?DNA 粘性末端附近的一小段順序，因此只要一個(gè)質(zhì)粒接上此粘性末端順序，再加上外源 DNA片段使其長(zhǎng)度為野生型 ?DNA大小的75－ 105%，重組體可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配 , 形成噬菌體顆粒 , 感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多 , 進(jìn)入宿主細(xì)胞后 , 只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增 , 并依賴抗藥性被篩選 .優(yōu)缺點(diǎn) : 。M13噬菌體 一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈 ssDNA，全長(zhǎng) , 感染大腸桿菌后 , ssDNA 轉(zhuǎn)變?yōu)?dsDNA, 可用作克隆載體 .最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈 DNA, 可制備單鏈 DNA探針 .構(gòu)建基因文庫的克隆載體粘粒 (Cosmid)細(xì)菌人工染色體 (BAC)酵母人工染色體 (YAC)P1噬菌體人工染色體 (PAC)P1及 YAC載體 酵母人工染色體，可容納外源基因片段長(zhǎng)達(dá) 200kb1000kb，含有酵母第 4號(hào)染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列 CEN ARS1，作為端粒的 Tel序列，選擇性標(biāo)志 URA TRP1和 SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組 DNA文庫構(gòu)建。v Zeocin抗性基因，可作為大腸桿菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記。EB病毒EB病毒vEpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )是人類皰疹病毒, 可轉(zhuǎn)化人的 B淋巴細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中以染色體外附加體形式存在。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種 “限制 ”病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源 DNA的限制性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：A 用 3個(gè)字母代表來源的生物，如大腸桿菌 （ Escherichia coli）用 Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用 Hin表示。III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制 修飾兩種功能的酶。 II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到 DNA上，因而識(shí)別的是對(duì)稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識(shí)別非對(duì)稱序列。這些酶一般都比較小，亞基一般都在 200300個(gè)氨基酸左右。有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別 核苷酸順序和切割位置都相同 ，其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。 星號(hào)活性的識(shí)別形式常對(duì)標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別順序中兩側(cè)的堿基沒有特異性。一個(gè) 50μl的反應(yīng)體系中， 1μl的酶在 1X Buffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng) 1小時(shí)即可降解 1μg已純化好的 DNA。應(yīng)用中的注意點(diǎn)2. 選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物 DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接加酶 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。 DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素緩沖液 對(duì)于每一種酶都提供相應(yīng)的最佳緩沖液，可保證酶活性。因此酶： DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。我們使用如下反應(yīng)終止液： 50%的甘油， 50mM EDTA（ ），和 %溴酚藍(lán)（ 10μl/50μl 反應(yīng)液）。1貯存 大部分酶應(yīng)貯存于 20℃ 。高于 20℃ 條件下穩(wěn)定性將有所降低1對(duì)照反應(yīng) 如果發(fā)現(xiàn) DNA底物不能被成功切開，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計(jì)算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。一般酶的最適溫度為 37 oC，但有例外。提高限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度 DNA制劑的反應(yīng)效率，可采用的方法v增加限制性核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物 DNA可高達(dá) 10個(gè)活性單位甚至更多些。有些酶在高的甘油濃度中會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力。：酶切條件與外源 DNA沒有區(qū)別。現(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。催化相鄰 DNA鏈的 5’P 和 3’OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合。1. Weiss單位（ Weiss等 ,1968），是指在 37oC下 20分鐘內(nèi)催化 1nM 32P從焦磷酸根置換到 [?,?32P] ATP所需酶量；2. （ NEB公司，粘性末端）將 1?g由 HindIII酶解的?DNA的 12堿基對(duì)粘性末端在 160C條件下、 30分鐘、 20?l反應(yīng)體系中連接 50?時(shí)所需酶量。 相同末端：直接將外源 DNA和載體片段加在一起，進(jìn)行連接；不同末端：需要將外源 DNA和載體 DNA的末端調(diào)整成一致。雙酶切：直接連接，并且方向是確定的，所以選擇這一方案時(shí)，要考慮其方向性。DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來確定。連接反應(yīng)：H2O 補(bǔ)充使總體 10ulATP（含在 buffer 中） 10XBuffer 1ul外源 DNA 1ul載體 DNA 34ulT4DNA連接酶 1ul 外源基因與載體的連接粘性末端連接演講完畢，謝謝觀看！
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