dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述-文庫(kù)吧
2025-12-15 02:37 本頁(yè)面
【正文】 對(duì)克隆后的 PCR產(chǎn)物使用 M13 primers進(jìn)行 DNA測(cè)序。 原核生物表達(dá)載體Bacterial expression vector復(fù)制起點(diǎn)克隆位點(diǎn)篩選標(biāo)記啟動(dòng)子 ﹡轉(zhuǎn)錄終止序列 ﹡核糖體結(jié)和位點(diǎn)：起始密碼子 ATG和 SD序列（翻譯識(shí)別）原核生物表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)單元包括： 真核生物表達(dá)載體（ mammalian expression vector)真核生物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)單元復(fù)制起點(diǎn)（真核和原核）克隆位點(diǎn)篩選標(biāo)記 (原核和真核標(biāo)記）增強(qiáng)子 /啟動(dòng)子 ﹡PolyA ﹡終止信號(hào)Location of FeaturesPCMV IE: CMV IE enhancer: 1659 CMV IE promoter: 669750 Intervening sequence (IVS): 8901022 T7 RNA polymerase promoter: 10671085 Multiple cloning site: 10851137 T3 RNA polymerase promoter: 11581137 SV40 fragment containing polyadenylation signal: 11671388 f1 origin of replication: 14831938 EGFP expression cassette: 20233455 SV40 enhancer/early promoter: 20232420 EGFP structural gene: 24493168 Kozak consensus translation initiation site: 24422452 Start codon (ATG): 24492451。 Stop codon: 31663168 Insertion of Val at position 2: 24522454 GFPmut1 chromophore mutations (Phe64 to Leu。 Ser65 to Thr): 27312735 His231 to Leu mutation (AT): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 31823455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (blactamase) gene: 34494709 Start codon (ATG): 38493451 Stop codon (TAA): 47074709 噬菌體載體vλ噬菌體 (λphage)? 外源 DNA： 9~23kb? 常用： EMBL 系列、 λgt 系列、 charon系列v粘性質(zhì)粒 (cosmid)： λDNA的 cos區(qū) +質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀 DNA，克隆容量：40~50kbvM13噬菌體λ噬菌體 (λphage) 特點(diǎn)：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀 DNA分子，長(zhǎng)度 , 分子兩端各有一個(gè) 12bp組成的粘性末端 , 感染大腸桿菌后 ,線狀 DNA通過(guò)粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán) , 連接處稱 COS位點(diǎn)。 1. 本身有復(fù)制體系 。 2. 中間 (JN間 ) 是 λ生長(zhǎng)非必需區(qū) , 可被其它外源 DNA取代 。 3. λDNA在體外可包裝成病毒顆粒 , 感染效率高 。 4. 載體容量大 ,可裝入大片段外源 DNA (20kb)。 5. 可人工加入多克隆位點(diǎn) 。 6. 篩選容易 —— 噬菌斑篩選 。 7. 主要用于 DNA文庫(kù)構(gòu)建 .插入型載體 —— 含單一的限制性酶切位點(diǎn)，可接受 10kb以下的外源片段，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建；取代型載體 —— 含某一限制性酶的兩個(gè)切點(diǎn)，可接受 20kb左右的外源片段，可用于基因組 DNA文庫(kù)構(gòu)建。v粘性質(zhì)粒 (cosmid) 是一種人工改造的載體 ,雙鏈環(huán)狀 DNA， 含有 λDNA的 cos區(qū) +質(zhì)粒，克隆容量： 40 ~ 50kb 1. λDNA的 COS位點(diǎn) 。 2. 質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記 (Ampr)。 3. 多種單一的酶切位點(diǎn) .vcosmid較小 , 約 4 – 6kb , 可容納 4045kb的外源 DNA,由于 ?噬菌體 DNA包裝時(shí)包裝蛋白識(shí)別的只是 ?DNA 粘性末端附近的一小段順序，因此只要一個(gè)質(zhì)粒接上此粘性末端順序，再加上外源 DNA片段使其長(zhǎng)度為野生型 ?DNA大小的75－ 105%，重組體可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配 , 形成噬菌體顆粒 , 感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多 , 進(jìn)入宿主細(xì)胞后 , 只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增 , 并依賴抗藥性被篩選 .優(yōu)缺點(diǎn) : 。 DNA的方式擴(kuò)增 。 DNA片段 。 主要用于真核基因的克隆 , 基因組文庫(kù)構(gòu)建 : 產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。M13噬菌體 一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈 ssDNA，全長(zhǎng) , 感染大腸桿菌后 , ssDNA 轉(zhuǎn)變?yōu)?dsDNA, 可用作克隆載體 .最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈 DNA, 可制備單鏈 DNA探針 .構(gòu)建基因文庫(kù)的克隆載體粘粒 (Cosmid)細(xì)菌人工染色體 (BAC)酵母人工染色體 (YAC)P1噬菌體人工染色體 (PAC)P1及 YAC載體 酵母人工染色體，可容納外源基因片段長(zhǎng)達(dá) 200kb1000kb，含有酵母第 4號(hào)染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列 CEN ARS1，作為端粒的 Tel序列，選擇性標(biāo)志 URA TRP1和 SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組 DNA文庫(kù)構(gòu)建。一個(gè)典型的 YAC系列載體v 病毒載體 DNA病毒在細(xì)胞中具有較高的拷貝數(shù)，
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