dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述-免費(fèi)閱讀
【正文】 DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來(lái)確定。 相同末端：直接將外源 DNA和載體片段加在一起，進(jìn)行連接；不同末端：需要將外源 DNA和載體 DNA的末端調(diào)整成一致。催化相鄰 DNA鏈的 5’P 和 3’OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合。：酶切條件與外源 DNA沒(méi)有區(qū)別。提高限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度 DNA制劑的反應(yīng)效率，可采用的方法v增加限制性核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物 DNA可高達(dá) 10個(gè)活性單位甚至更多些。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計(jì)算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。1貯存 大部分酶應(yīng)貯存于 20℃ 。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。 DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素緩沖液 對(duì)于每一種酶都提供相應(yīng)的最佳緩沖液，可保證酶活性。應(yīng)用中的注意點(diǎn)2. 選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物 DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。 星號(hào)活性的識(shí)別形式常對(duì)標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別順序中兩側(cè)的堿基沒(méi)有特異性。這些酶一般都比較小，亞基一般都在 200300個(gè)氨基酸左右。 II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來(lái)源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：A 用 3個(gè)字母代表來(lái)源的生物，如大腸桿菌 （ Escherichia coli）用 Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用 Hin表示。EB病毒EB病毒vEpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )是人類皰疹病毒, 可轉(zhuǎn)化人的 B淋巴細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中以染色體外附加體形式存在。M13噬菌體 一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈 ssDNA，全長(zhǎng) , 感染大腸桿菌后 , ssDNA 轉(zhuǎn)變?yōu)?dsDNA, 可用作克隆載體 .最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈 DNA, 可制備單鏈 DNA探針 .構(gòu)建基因文庫(kù)的克隆載體粘粒 (Cosmid)細(xì)菌人工染色體 (BAC)酵母人工染色體 (YAC)P1噬菌體人工染色體 (PAC)P1及 YAC載體 酵母人工染色體，可容納外源基因片段長(zhǎng)達(dá) 200kb1000kb，含有酵母第 4號(hào)染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列 CEN ARS1，作為端粒的 Tel序列，選擇性標(biāo)志 URA TRP1和 SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組 DNA文庫(kù)構(gòu)建。 6. 篩選容易 —— 噬菌斑篩選 。 原核生物表達(dá)載體Bacterial expression vector復(fù)制起點(diǎn)克隆位點(diǎn)篩選標(biāo)記啟動(dòng)子 ﹡轉(zhuǎn)錄終止序列 ﹡核糖體結(jié)和位點(diǎn)：起始密碼子 ATG和 SD序列（翻譯識(shí)別）原核生物表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)單元包括： 真核生物表達(dá)載體（ mammalian expression vector)真核生物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)單元復(fù)制起點(diǎn)（真核和原核）克隆位點(diǎn)篩選標(biāo)記 (原核和真核標(biāo)記）增強(qiáng)子 /啟動(dòng)子 ﹡PolyA ﹡終止信號(hào)Location of FeaturesPCMV IE: CMV IE enhancer: 1659 CMV IE promoter: 669750 Intervening sequence (IVS): 8901022 T7 RNA polymerase promoter: 10671085 Multiple cloning site: 10851137 T3 RNA polymerase promoter: 11581137 SV40 fragment containing polyadenylation signal: 11671388 f1 origin of replication: 14831938 EGFP expression cassette: 20233455 SV40 enhancer/early promoter: 20232420 EGFP structural gene: 24493168 Kozak consensus translation initiation site: 24422452 Start codon (ATG): 24492451。Bam HI。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；? 松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有 10200份拷貝v 不相容質(zhì)粒攜帶復(fù)制子基本相似，復(fù)制系統(tǒng)也相同，在復(fù)制和分配到子細(xì)胞的過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)。是一種環(huán)狀的雙鏈 DNA分子，大小從 1K200Kb。v 根據(jù)來(lái)源： plasmid。DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建醫(yī)學(xué)生物所 病毒免疫室 基因克隆 gene cloning應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將 目的基因 與 載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子（重組體 ），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)菌或細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌或細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝 。 phage。v通常質(zhì)粒含有某些染色體沒(méi)有的基因，負(fù)責(zé)編碼某些功能蛋白，這些功能并不是細(xì)菌生存所必需的，但在一定環(huán)境下，可對(duì)細(xì)菌宿主的生存有利。v 質(zhì)粒 DNA所編碼的基因產(chǎn)物賦予細(xì)菌某些性狀特征。 Sal I篩選標(biāo)記 :Ampr。 Stop codon: 31663168 Insertion of Val at position 2: 24522454 GFPmut1 chromophore mutations (Phe64 to Leu。 7. 主要用于 DNA文庫(kù)構(gòu)建 .插入型載體 —— 含單一的限制性酶切位點(diǎn)，可接受 10kb以下的外源片段，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建；取代型載體 —— 含某一限制性酶的兩個(gè)
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