dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 常見(jiàn)的基因工程載體載體： 用于攜帶重組 DNA，并且能夠使外源 DNA一起復(fù)制與表達(dá)的運(yùn)載工具。核心技術(shù)： DNA重組技術(shù) （ rebinant DNA technique ）基因克隆的基本程序： 分 — 切 — 接 — 轉(zhuǎn) — 篩 PCR 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 抗性或標(biāo)記篩選目的基因 DNA片段的獲得外源 DNA分子與載體 DNA分子的體外重組重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w菌或細(xì)胞重組 DNA 分子克隆的篩選和鑒定目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定基因克隆技術(shù)的特點(diǎn)： 1. 可在體外人工的 , 有目的的 , 根據(jù)需要進(jìn)行基因的重組、表達(dá)、測(cè)序、誘變、修復(fù)； 2. 方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異，能保證研究與開(kāi)發(fā)的需要。 viral。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性（ R因子）、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子 col）、 腸毒素及限制酶、修飾酶等。v 質(zhì)粒并非細(xì)菌生存所必不可少的遺傳物質(zhì)，可以在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移與丟失。Tvector PCR產(chǎn)物亞克隆載體 T— Vector是一種高效克隆 PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體，由 pUC18載體改建而成的。 Ser65 to Thr): 27312735 His231 to Leu mutation (AT): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 31823455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (blactamase) gene: 34494709 Start codon (ATG): 38493451 Stop codon (TAA): 47074709 噬菌體載體vλ噬菌體 (λphage)? 外源 DNA： 9~23kb? 常用： EMBL 系列、 λgt 系列、 charon系列v粘性質(zhì)粒 (cosmid)： λDNA的 cos區(qū) +質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀 DNA，克隆容量：40~50kbvM13噬菌體λ噬菌體 (λphage) 特點(diǎn)：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀 DNA分子，長(zhǎng)度 , 分子兩端各有一個(gè) 12bp組成的粘性末端 , 感染大腸桿菌后 ,線狀 DNA通過(guò)粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán) , 連接處稱 COS位點(diǎn)。v粘性質(zhì)粒 (cosmid) 是一種人工改造的載體 ,雙鏈環(huán)狀 DNA， 含有 λDNA的 cos區(qū) +質(zhì)粒，克隆容量： 40 ~ 50kb 1. λDNA的 COS位點(diǎn) 。諸如：SV40（猴腎病毒）EpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )牛乳頭瘤病毒（ BPV）昆蟲(chóng)桿狀病毒（ baculovirus)v由于存在容量小、宿主范圍小等缺陷，天然SV40病毒作為載體很少被使用，多數(shù)載體為帶有來(lái)自 SV40中轉(zhuǎn)錄元件的質(zhì)粒型載體v SV40增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和復(fù)制子，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生高效的組成型表達(dá)?？稍诙喾N細(xì)胞中表達(dá)，可表達(dá)基因組 DNA和 cDNA,可為表達(dá)細(xì)胞系。其特點(diǎn)是識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，沒(méi)有固定切割位點(diǎn)。II型限制性內(nèi)切酶中最普遍的是象 Hha I、 Hind III和Not I這樣在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶。 如 XbaⅠ(T`CTAGA) 、 Nhe Ⅰ(G`CTAGC ） 、 Spe Ⅰ (A`CTAGT) 切割的 DNA序列不同，但均給出相同的 “CTAG”粘性末端。星號(hào)活力克?。ㄓ袝r(shí)與甲基化酶聯(lián)用）鑒定（基因片斷大小、正反向）檢測(cè)突變（識(shí)別位點(diǎn)，限制酶切圖譜的多態(tài)性 RFLP）制作 Marker限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng)包含：1. DNA2. 合適的酶緩沖液3. 蛋白酶4. 為了提高酶切效率，可加入BSA?；?539。有的酶要求100μg/ml 的 BSA以實(shí)現(xiàn)最佳活性。一般為 5065℃ 不等反應(yīng)時(shí)間 1酶活單位的定義時(shí)間為 1小時(shí)。 10X BUFFER 和 100X BSA于 20℃ 保存。D）加入計(jì)算好的 DNA， 10X反應(yīng)液，酶。v延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。目前商業(yè)化載體均有多克隆位點(diǎn)，含有多個(gè)酶切位點(diǎn)，可以進(jìn)行多種選擇和取舍。 T4噬菌體 DNA連接酶還有一種 E. coli DNA連接酶沒(méi)有的特性即將兩個(gè)平末端的雙鏈 DNA分子連接起來(lái)的功能。單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體，通常用去磷酸化的方法以避免。有的加入聚乙二醇。理論上講連接反應(yīng)的最佳溫度是 37℃ ，此時(shí)連接酶的活性最高。 相當(dāng)于 ATPPpi交換反應(yīng)中 Weiss U。數(shù)據(jù)庫(kù) 限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫(kù) 其中含有已知的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識(shí)別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)。： 根據(jù)重組的需要，有時(shí)需要用雙酶切（單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體），這樣重組效果會(huì)更好。舉例質(zhì)粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul10X反應(yīng)液 5 ul內(nèi)切酶 2uldH2O 38 ul總體積 50 ul37 oC保溫 23小時(shí)。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明底物 DNA降解，則說(shuō)明 DNA在純化過(guò)程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對(duì)照 DNA被成功切開(kāi)，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照 DNA和待切底物 DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反
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