dna重組質粒的構建概述-文庫吧在線文庫
【正文】 常見的基因工程載體載體： 用于攜帶重組 DNA，并且能夠使外源 DNA一起復制與表達的運載工具。核心技術： DNA重組技術 （ rebinant DNA technique ）基因克隆的基本程序： 分 — 切 — 接 — 轉 — 篩 PCR 酶切 連接 轉化 轉染 抗性或標記篩選目的基因 DNA片段的獲得外源 DNA分子與載體 DNA分子的體外重組重組 DNA分子轉移到適當的受體菌或細胞重組 DNA 分子克隆的篩選和鑒定目的基因或其表達產物的純化和鑒定基因克隆技術的特點： 1. 可在體外人工的 , 有目的的 , 根據需要進行基因的重組、表達、測序、誘變、修復； 2. 方法簡便、快速、準確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。 viral。由質粒產生的表型包括對抗生素的抗性（ R因子）、產生抗生素、降解復雜有機化合物、產生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子 col）、 腸毒素及限制酶、修飾酶等。v 質粒并非細菌生存所必不可少的遺傳物質，可以在細菌間轉移與丟失。Tvector PCR產物亞克隆載體 T— Vector是一種高效克隆 PCR產物 (TA Cloning) 的專用載體，由 pUC18載體改建而成的。 Ser65 to Thr): 27312735 His231 to Leu mutation (AT): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 31823455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (blactamase) gene: 34494709 Start codon (ATG): 38493451 Stop codon (TAA): 47074709 噬菌體載體vλ噬菌體 (λphage)? 外源 DNA： 9~23kb? 常用： EMBL 系列、 λgt 系列、 charon系列v粘性質粒 (cosmid)： λDNA的 cos區(qū) +質粒，雙鏈環(huán)狀 DNA，克隆容量：40~50kbvM13噬菌體λ噬菌體 (λphage) 特點：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀 DNA分子，長度 , 分子兩端各有一個 12bp組成的粘性末端 , 感染大腸桿菌后 ,線狀 DNA通過粘性末端互補連接成環(huán) , 連接處稱 COS位點。v粘性質粒 (cosmid) 是一種人工改造的載體 ,雙鏈環(huán)狀 DNA， 含有 λDNA的 cos區(qū) +質粒，克隆容量： 40 ~ 50kb 1. λDNA的 COS位點 。諸如：SV40（猴腎病毒）EpsteinBarr病毒 (EBV病毒 )牛乳頭瘤病毒（ BPV）昆蟲桿狀病毒（ baculovirus)v由于存在容量小、宿主范圍小等缺陷，天然SV40病毒作為載體很少被使用，多數載體為帶有來自 SV40中轉錄元件的質粒型載體v SV40增強子、啟動子和復制子，可以在哺乳動物細胞中產生高效的組成型表達?？稍诙喾N細胞中表達，可表達基因組 DNA和 cDNA,可為表達細胞系。其特點是識別位點和切割位點不一致，沒有固定切割位點。II型限制性內切酶中最普遍的是象 Hha I、 Hind III和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。 如 XbaⅠ(T`CTAGA) 、 Nhe Ⅰ(G`CTAGC ） 、 Spe Ⅰ (A`CTAGT) 切割的 DNA序列不同，但均給出相同的 “CTAG”粘性末端。星號活力克隆（有時與甲基化酶聯(lián)用）鑒定（基因片斷大小、正反向）檢測突變（識別位點，限制酶切圖譜的多態(tài)性 RFLP）制作 Marker限制性內切酶的應用限制性內切酶的使用一個標準的酶切反應包含：1. DNA2. 合適的酶緩沖液3. 蛋白酶4. 為了提高酶切效率，可加入BSA。或 539。有的酶要求100μg/ml 的 BSA以實現最佳活性。一般為 5065℃ 不等反應時間 1酶活單位的定義時間為 1小時。 10X BUFFER 和 100X BSA于 20℃ 保存。D）加入計算好的 DNA， 10X反應液，酶。v延長酶催化反應的保溫時間。目前商業(yè)化載體均有多克隆位點，含有多個酶切位點，可以進行多種選擇和取舍。 T4噬菌體 DNA連接酶還有一種 E. coli DNA連接酶沒有的特性即將兩個平末端的雙鏈 DNA分子連接起來的功能。單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體，通常用去磷酸化的方法以避免。有的加入聚乙二醇。理論上講連接反應的最佳溫度是 37℃ ，此時連接酶的活性最高。 相當于 ATPPpi交換反應中 Weiss U。數據庫 限制性內切酶的數據庫 其中含有已知的所有限制性內切酶的完整表，包括識別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻。： 根據重組的需要，有時需要用雙酶切（單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體），這樣重組效果會更好。舉例質粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul10X反應液 5 ul內切酶 2uldH2O 38 ul總體積 50 ul37 oC保溫 23小時。若實驗結果表明底物 DNA降解，則說明 DNA在純化過程中或反應液里引入了核酸酶污染；若實驗結果發(fā)現底物DNA保持完整，而對照 DNA被成功切開，則可以排除酶質量的原因，此時可以將對照 DNA和待切底物 DNA混合起來再次進行反
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