dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述(已修改)
2026-01-11 02:37 本頁(yè)面
【正文】 DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建醫(yī)學(xué)生物所 病毒免疫室 基因克隆 gene cloning應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將 目的基因 與 載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子（重組體 ），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)菌或細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌或細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝 。核心技術(shù)： DNA重組技術(shù) （ rebinant DNA technique ）基因克隆的基本程序： 分 — 切 — 接 — 轉(zhuǎn) — 篩 PCR 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 抗性或標(biāo)記篩選目的基因 DNA片段的獲得外源 DNA分子與載體 DNA分子的體外重組重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w菌或細(xì)胞重組 DNA 分子克隆的篩選和鑒定目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定基因克隆技術(shù)的特點(diǎn)： 1. 可在體外人工的 , 有目的的 , 根據(jù)需要進(jìn)行基因的重組、表達(dá)、測(cè)序、誘變、修復(fù)； 2. 方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。v基因克隆示意圖胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素 2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素 EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子 Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體例：干擾素是治療癌癥的重要物質(zhì)，人血液中每升只能提取，因而其價(jià)格昂貴。但美國(guó)有一家公司用遺傳工程方法合成了價(jià)格低廉、藥性一樣的干擾素，其具體做法是：從人的淋巴細(xì)胞中提取能指導(dǎo)干擾素合成的基因，并使之與一種叫做質(zhì)粒的 DNA結(jié)合，然后移植到酵母菌內(nèi)，從而用酵母菌來(lái)產(chǎn)生干擾素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在較短的時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)干擾素。利用這種方法不僅產(chǎn)量高，并且成本也較低 。DNA重組操作過(guò)程載體外源 DNA片段外源 DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞a b bA重組A b抗性篩選重組篩選重組質(zhì)粒構(gòu)建： 目的 DNA的 PCR擴(kuò)增 DNA片段和載體的 酶切 片段 DNA與載體的 連接載體： plasmid（ primary）工具酶：限制性內(nèi)切酶 連接酶 常見的基因工程載體載體： 用于攜帶重組 DNA，并且能夠使外源 DNA一起復(fù)制與表達(dá)的運(yùn)載工具。v 根據(jù)來(lái)源： plasmid。 phage。 viral。 BAC。 YACv 根據(jù)用途分：克隆載體；原核生物表達(dá)載體；真核生物表達(dá)載體v 根據(jù)與宿主的關(guān)系分：整合性載體、非整合性載體v 基因工程中用得最多的是 plasmid載體。下面介紹幾種常見的載體。載體的基本結(jié)構(gòu)單元：其他條件：：包括宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。質(zhì)粒 (Plasmid)質(zhì)粒是獨(dú)立于宿主細(xì)胞（如細(xì)菌）染色體之外的可進(jìn)行復(fù)制和遺傳的遺傳單位 雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋 DNA分子 。是一種環(huán)狀的雙鏈 DNA分子，大小從 1K200Kb。v通常質(zhì)粒含有某些染色體沒有的基因，負(fù)責(zé)編碼某些功能蛋白，這些功能并不是細(xì)菌生存所必需的，但在一定環(huán)境下，可對(duì)細(xì)菌宿主的生存有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性（ R因子）、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子 col）、 腸毒素及限制酶、修飾酶等。v 質(zhì)粒存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身染色體的同一組酶系。質(zhì)粒 DNA的特征216。 質(zhì)粒復(fù)制依賴宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)器，但可以獨(dú)立復(fù)制。（單拷貝或多拷貝：緊密型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒）? 嚴(yán)緊型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；? 松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有 10200份拷貝v 不相容質(zhì)粒攜帶復(fù)制子基本相似，復(fù)制系統(tǒng)也相同，在復(fù)制和分配到子細(xì)胞的過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)。v 質(zhì)粒 DNA所編碼的基因產(chǎn)物賦予細(xì)菌某些性狀特征。v 質(zhì)粒并非細(xì)菌生存所必不可少的遺傳物質(zhì)，可以在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移與丟失。v 質(zhì)?？勺孕惺セ蚪?jīng)人工處理而消失v 可有幾種質(zhì)粒同時(shí)共存在于一個(gè)細(xì)菌內(nèi)，但同群質(zhì)粒有不相容性（同群質(zhì)粒具有同源性，可以產(chǎn)生相同的阻遏蛋白，故彼此間有相互抑制作用，不能共存于同一細(xì)胞）（四）人工構(gòu)建質(zhì)粒的基本元件v 啟始復(fù)制子：使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制v 抗性基因：用于篩選陽(yáng)性克隆。v 多克隆位點(diǎn)：插入外源基因。對(duì)于表達(dá)載體還需要啟動(dòng)子、多聚 A尾等 .易于操作：包括宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。pBR322 plasmid 是一個(gè)克隆載體，作為一個(gè)克隆載體最基本的要求都具備：復(fù)制起點(diǎn) :Ori克隆位點(diǎn) :EcoR I。 Hind III。Bam HI。 Sal I篩選標(biāo)記 :Ampr。Tvector PCR產(chǎn)物亞克隆載體 T— Vector是一種高效克隆 PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體，由 pUC18載體改建而成的。在 pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的 Xba I 和 Sal I 識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V 識(shí)別位點(diǎn)，用 EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的 3‘端添加 “T”而成。因大部分耐熱性 DNA聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在 PCR產(chǎn)物的 3’末端添加一個(gè) “A”的特性 ,所以用本制品可大大提高 PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。 Tvector 克隆 PCR產(chǎn)物時(shí)用高效連接液 Ligation Solution I 可以在極短的時(shí)間內(nèi) (30分鐘～ 1小時(shí) ) 完成連接反應(yīng)，大大地方便了實(shí)驗(yàn)操作。 用途 克隆 PCR產(chǎn)物。
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