質(zhì)粒dna的提取、酶切及檢測(cè)(已修改)
2025-06-07 18:28 本頁(yè)面
【正文】 質(zhì)粒 DNA的提取、酶切及檢測(cè) 相關(guān)知識(shí) ? 基因工程又稱 DNA重組技術(shù) 外源基因通過(guò)體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能夠在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)的操作 ? 包括基因的分離 、 重組 、 轉(zhuǎn)移 、 基因在受體細(xì)胞內(nèi)的保持 、 轉(zhuǎn)錄 、 翻譯表達(dá)等全過(guò)程 ? 基因工程四要素：目的基因 、 工具酶 、 載體 、受體細(xì)胞 常用到的工具酶 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 連接酶 ? 聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 ? DNA酶和 RNA酶 結(jié)構(gòu)的三大要素： ? 多克隆位點(diǎn) ? 選擇標(biāo)記（耐藥性） ? 獨(dú)立的復(fù)制單位 種類： ? 質(zhì)粒 ? 噬菌體 ? 酵母人工染色體（ YAC） 載 體 質(zhì) 粒 （ plasmid） ? 是染色體外小型（ 1200kb） 的 共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈 DNA分子（ cccDNA）， 能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 ? 常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等 ? 質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（ 1~n個(gè) ） 松弛型復(fù)制（ 20個(gè)以上） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的原理與操作、限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并理解限制性內(nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定 DNA片段的有效方法。 第一部分 質(zhì)粒 DNA的提取 堿裂解法 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理與操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 在 EDTA存在的條件下，經(jīng)過(guò) NaOH和陰離子去污劑 SDS處理，使細(xì)胞膜崩解，從而達(dá)到菌體充分的裂解。 ? 此時(shí)，細(xì)菌染色體 DNA纏繞附著在細(xì)胞膜碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)。 ? 而質(zhì)粒 DNA則留在上清液內(nèi)，其中還含有蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中加入堿性酚（ ）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白質(zhì)。 ? 含有質(zhì)粒 DNA的上清液用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。 三、主要試劑 溶液 I， 50 mM葡萄糖 / 25 mM TrisCl / 10 mM EDTA， pH ； T
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