質(zhì)粒dna的提取、酶切及檢測-資料下載頁
2025-05-26 18:28本頁面
【正文】 、 瓊脂糖凝膠的濃度 、DNA的構(gòu)象 、 所加電壓 一般 5V/cm、 電場方向 、 嵌入染料的存在 、 電泳緩沖液的組成 。 常用染料 ? EB:溴化乙錠 ， 能插入 DNA分子堿基對(duì)之間 。 DNA吸收的 260nm的紫外光傳遞給 EB， 或者結(jié)合的 EB本身在 300和 360吸收的射線 ， 呈橙紅色 。 ? EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便 ， 快速 ； 靈敏度高；可以加到樣品中或膠中 。 ? EB是誘變劑 ， 使用時(shí)一定要戴手套 。 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄 。 ? GoldView I是一種可代替溴化乙錠 （ EB） 的新型核酸染料 ， 與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào) ，在紫外透射光下雙鏈 DNA呈現(xiàn)綠色熒光 。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA的方法和技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 核酸 pH8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。 相同堿基數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。不同分子量的 DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。可以近似用于估算分子的大小。 ? 可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。 共價(jià)閉環(huán)超螺旋 DNA（ cccDNA）＞ 直線 DNA（ LDNA， 2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ ocDNA， 1條鏈發(fā)生斷裂）。 三、實(shí)驗(yàn)操作步驟 ? 瓊脂糖凝膠的制備 ? 凝膠板的制備 ? 加樣 ? 電泳 ? 結(jié)果觀察 ? 將 100 ml的 1 TBE電泳液中 ,配制成 %瓊脂糖凝膠溶液 ? 當(dāng)瓊脂糖溶液的溫度降至 60℃ ～ 80℃ 時(shí)，加入 GoldView I使其終濃度約為 ,混勻后，迅速傾入預(yù)先安裝好的凝膠板中。 ? 待其凝固后，小心取下梳齒，備用。 ? 加樣至樣品孔中電泳 ,調(diào)至恒壓 80v，使 DNA向陽性方向移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約 1～ 2cm處，停止電泳。 ? 紫外燈下觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行拍照。 Relaxed circle Linearized form Supercoiled form 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 ? 根據(jù)觀察結(jié)果，繪圖。 ? 分析自提質(zhì)粒的情況以及酶切情況。
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