質(zhì)粒提取和酶切分析-資料下載頁(yè)
2025-05-26 18:28本頁(yè)面
【正文】 5 ml LB液體培養(yǎng)基 (含 100μg/ml Amp)的試管中 ， 37℃ 搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜 。 3． 取 1ml菌液加入 EP管中 ， 12 000r/min離心 2min，棄上清 ， 真空抽吸注意換頭 。 4. 加入預(yù)置 4 ℃ 的 STE 溶液 100 μl重懸菌斑 ， 12 000r/min離心 1min， 棄上清 。 5． 在沉淀中加入溶液 Ⅰ 100μl重懸菌斑 ， 4 ℃ 靜置 510min。 6． 加入 200μl新鮮配制的溶液 Ⅱ ， 顛倒數(shù)次 ， 輕輕混勻 ，冰浴 5～ 10min(溶液變透明 ， 粘稠 ， 切忌延長(zhǎng) )。 7． 加入溶液 Ⅲ 150μl， 顛倒混勻 ， 冰浴 5～ 10min(溶液出現(xiàn)白色沉淀 ) 8． 15 000r/min離心 10min， 將上清轉(zhuǎn)移至另一 EP管中 。 9． 加等體積酚抽提 1次 ， 15 000r/min離心 3min， 取上層水相轉(zhuǎn)移至另一 EP管 。 10． 加等體積氯仿抽提 1次 ， 15 000r/min離心 30sec， 取上層水相轉(zhuǎn)移至另一 EP管 。 11． 加入 2倍體積無(wú)水乙醇 （ 預(yù)置 20 ℃ ） ， 再加入 1/10體積的 3M NaAc， 20 ℃ 放置 30min； 15 000r/min離心 10min， 棄上清 。 12． 用 70%乙醇洗滌沉淀 ， 8 000r/min， 離心 10min， 棄乙醇 ， 室溫下靜置使乙醇揮發(fā)或真空干燥 。 13． 用 30μl ddH2O溶解 DNA沉淀 ， 并加入 3μl RNase,， 37℃ 水浴30min， 20℃ 保存 。 四、結(jié)果檢測(cè) 電泳： 質(zhì)粒 DNA的存在形式有 3種：①共價(jià)閉環(huán) DNA，常以超螺旋形式存在；②開(kāi)環(huán) DNA，此種質(zhì)粒 DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂；③線性 DNA，因質(zhì)粒 DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。在電泳時(shí)同一質(zhì)粒 DNA的 3種形式泳動(dòng)速度：超螺旋＞線性＞開(kāi)環(huán) 抽提產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、 EB染色后，在紫外線燈下可觀察到三條帶，自前往后分別為：超螺旋、線性及開(kāi)環(huán)質(zhì)粒 DNA。 ? 定量檢測(cè) ： 質(zhì)粒 1： 100稀釋，檢測(cè) OD260（雙鏈 DNA在 ～ )，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度（ 1 OD260 =50μg質(zhì)粒 DNA/ml） 1. 菌體老化 2. 堿裂解不充分 3. 菌體中無(wú)質(zhì)粒 4. 溶液使用不當(dāng) 1. 請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng) 2. 可減少菌體用量或增加溶液的用量 3. 不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。 4. 溶液 Ⅱ 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，臵于 37℃ 保溫片刻直至溶解為清亮的溶液 。 五、質(zhì)粒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？ 原因 對(duì) 策 1. 混有蛋白 2. 混有 RNA 3. 混有基因組 DNA 1. 不要使用過(guò)多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì) 2. 加入 RNaseA室溫放臵一段時(shí)間 3. 加入溶液 II 和 III后 防止劇烈振蕩，可能把基因組 DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和 DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò) 16小時(shí)。 五、質(zhì)粒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？ 原因 對(duì) 策 謝謝！
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