質(zhì)粒dna的酶切鑒定-資料下載頁
2025-05-26 18:28本頁面
【正文】 凝膠液，小心地倒在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。 室溫下靜置 30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內(nèi)槽放在含有 1 TAE（ Tris乙酸） 或 TBE（ Tris硼酸）工作液的電泳槽中使用。 4）加樣 用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約 15～ 20 ?l。 1 kb DNA ladder（能見到 10條帶） : 在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內(nèi)加入 6?l 的 1 kb DNA ladder（ 50ng/?l ）。 5）電泳（帶上手套操作） ? 加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳； ? 建議在 80～ 100V的電壓下電泳； ? 當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約 1cm處停止電泳； ? 將凝膠放入 溴化乙啶（ EB〕 工作液（ ?g/ml左右）中染色約 20min。 為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，電場強度不應高于 5V/cm（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進行。在瓊脂糖凝膠濃度低于 %時，由于膠太稀，最好在 4℃ 進行電泳以增加凝膠硬度。 6）觀察與拍照 在紫外燈 (310nm波長 )下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā) 30s左右，肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或有機玻璃防護面罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。拍照電泳圖譜時，可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。 對于未進行酶切的質(zhì)粒來說 ， 常會出現(xiàn)兩條電泳帶 ， 一條是 （ 松弛 ） 螺旋狀質(zhì)粒 DNA帶 ，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒 DNA的帶 ， 以超螺旋狀質(zhì)粒 DNA居多 ， 移動速度也最快 。 有時還會出現(xiàn)三條帶 ， 其中一條是因為有一些質(zhì)粒 DNA在提取過程中遭到損傷而線性化 ， 其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒 DNA之間 ， 所以該條電泳帶位于上述兩種帶之間 。 如果提取的質(zhì)粒很好時 ， 這條帶會很弱 ， 有時看不到 。 Relaxed circle Supercoiled form 學生實驗結(jié)果（ 3 個小組 ） 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 1. 未酶切質(zhì)粒； 2. EcoRI 單酶切； 3. EcoR1+XhoI雙酶切 M. 1kb DNA Marker.
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