實驗三、質(zhì)粒dna的酶切-資料下載頁
2025-08-15 21:25本頁面
【正文】 ? Buffer DEA：凝膠熔化劑，含 DNA保護劑，防止 DAN在高溫下降解。 一定溫度下 ( 75℃ ) ，使瓊脂糖凝膠融化。 ? Buffer DEB： 結(jié)合液： 是一種高鹽、低 PH值的溶液 ,作用 是使大于 70bp的 DNA片段選擇性結(jié)合到 吸附柱上的 DNA制備膜上 。 ? 異丙醇 :使 DNA分子更好的攔截在膜上，所以回收小于400bp的片段時，能提高回收效率 ? Buffer W1：洗滌液，將蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。 ? Buffer W2： 用前加入 等體積的 無水乙醇 混合均勻， 成分：一般是含 50％乙醇（ V/V）的 TE。 作用：將鹽份被完全清除，消除下游操作酶的影響。 ? Eluent： 洗脫緩沖液 ，低鹽濃度，高 pH值。一般用 TrisCl（ ），作用：將 DNA從硅基質(zhì)中洗脫 實驗三的 流程 ? 質(zhì)粒的提取 ? 酶切 ? 制膠，進行瓊脂糖凝膠電泳 ? 切膠， DNA回收 ? 電泳驗證回收效率 膠回收流程 切膠 ↓加入 DEA 膠溶解 ↓加入 DEB和 異丙醇 （ 提高回收率 ） 混勻 ↓加入吸附柱中 DNA結(jié)合到柱上 ↓加入洗滌 液 W1（ 除雜質(zhì) ） 離心 ↓加入洗滌 液 W2（ 除雜質(zhì) ） 離心 ↓加入洗滌 液 W2（ 除雜質(zhì) ） 離心 ↓加入 洗脫緩沖液 離心 洗脫 純凈 DNA （三） 酶切產(chǎn)物的割膠回收 用 AxyGEN割膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目的 DNA片段，步驟如下： 在紫外燈下用一鋒利刀片從凝膠中割取目的片段帶，測定重量（ mg）； 加入 3倍膠體積 (mg/?l) 的 Buffer DEA緩沖液； 懸浮均勻后于 75℃ 加熱，每隔 23 min混合一次，直至凝膠塊完全融化 （約 68 min）； 按 Buffer DEA體積的 50％加入 Buffer DEB，混合均勻。當(dāng)回收的 DNA片段小于 400 bp時，加入 1倍膠體積的異丙醇，混勻； 將以上樣品轉(zhuǎn)至 DNAprep Tube離心柱，離心柱置于 2 ml收集管上， 12022 rpm離心 1 min，棄濾液； 用 500 μl Buffer W1 洗柱， 12022 rpm離心 1 min，棄濾液； 用 700 μl 已加無水乙醇的 Buffer W2洗柱，12022 rpm離心 1 min，棄濾液，用同樣的方法再用 700 μl Buffer W2 洗滌一次； 將 DNAprep Tube置于 ml離心管中， 12022 rpm離心 1 min，以徹底去除 Buffer W2； 將 DNAprep Tube置于另一潔凈的 ml離心管中，在 silica膜中央加 2530 ?l Eluent以溶解柱中 DNA，室溫靜置 1 min， 12022 rpm離心 1 min，收集離心液即為 DNA溶液。 注意事項 : 1中，將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠融化時間（線性 DNA長時間暴露在高溫條件下易水解），從而提高回收率。勿將含 DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對 DNA造成的損傷。 2中凝膠必須完全熔化，否則嚴(yán)重影響 DNA回收率。 65℃ ，有利于提高洗脫效率。 ，建議在 mM TrisHCl， 液中保存 ,減少 DNA的脫氨反應(yīng) 。 DNA的凝膠。 得到凝膠體積越小越好，不然影響回收率。 DNA 片段一般在 100bp到 50kb之間，過長，過短片段的回收效率迅速降低。 ， Buffer W1中加入等體積的無水乙醇
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