質(zhì)粒提取和酶切分析-展示頁
2025-06-04 18:28本頁面
【正文】 ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 這種末端同樣可以通過 DNA連接酶連接起來。 如 EcoRI的識別順序為： 5’…… G|AATTC …… 3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成 5’…… G AATTC…… 3’ 3’…… CTTAA G…… 5’ 各有一個單鏈末端 ， 二條單鏈是互補的 ， 其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過 DNA連接酶的作用而 “ 粘合 ” 。 這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是 4個或 6個核苷酸 ， 少數(shù)也有識別 5個核苷酸以及 7個 、 8個 、 9個 、 10個和 11個核苷酸的 。 由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的 。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。這類酶如 EcoB、 EcoK等。 2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性 按限制酶的 亞基組成和 切斷核酸情況 的不同，分為三類： Ⅰ 型 Ⅱ 型 * Ⅲ 型 第一類（ I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割 DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割 DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶， 它們以此來限制外源 DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成 這種酶的細胞自身的 DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的 DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的 DNA不能起作用。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的 EcoR I和 EcoR II，以及來源于流感嗜血桿菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II和 Hind III。 它是基因工程中用于體外剪切基因片段的重要工具酶 。質(zhì)粒提取和酶切分析 中心實驗室 質(zhì)粒 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析 1. 實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、掌握對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法 ，并理解限制性內(nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具。 ?感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù) 2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈 DNA分子特異性核酸序列的 DNA水解酶 。 上世紀七十年代，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制 修飾現(xiàn)象進行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點切開 DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。 1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象 限制與修飾系統(tǒng)是 細菌細胞的一種防衛(wèi)手段。 這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。這類限制性內(nèi)切酶在 DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析 DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。 第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度 DNA片段，具有各種單鏈末端。 第二類 (II型 )限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序 ， 并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈 。 因此 ， 這種限制性內(nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一 。 這種酶的切割可以有兩種方式： 粘性末端 ；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以
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