【正文】 作用使蛋白質(zhì)脫水而趨于凝集、沉淀。 鹽析 ? 蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度，與溶液中的離子強度有關(guān)： ? Log(S/S0)=KsI ? LogS=LogS0KsI=? KsI ? S蛋白質(zhì)或酶在離子強度為 I 時的溶解度（ w/v) S0蛋白質(zhì)或酶在離子強度為 0時的溶解度 Ks鹽析常數(shù) I 離子強度 鹽析 ? 在一定的溫度和 pH條件下（ ?為常數(shù)），通過改變離子強度的方法可使不同的蛋白質(zhì)或酶分離，稱為 KS分段鹽析。 鹽析 ? 鹽析法的一個發(fā)展就是和色譜技術(shù)相結(jié)合形成鹽析色譜法 (salting out chromatography)， 即以瓊脂糖等非極性物質(zhì)為柱色譜的支持體，在高濃度條件下將樣品中的蛋白質(zhì)鹽析吸附，然后再梯度地降低鹽類濃度，使酶和雜蛋白分別洗脫出來。蛋白質(zhì)濃度在 1mg/ml以上，低溫。 球蛋白溶解度 溶液離子強度關(guān)系 鹽析 ? 中性鹽類使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的原因： ? 1).中和蛋白質(zhì)分子表面電荷 ? 2).與蛋白質(zhì)顆粒競爭水分子 ? 不同蛋白質(zhì)表面極性基團、帶電數(shù)目及分布等不同，因而可以分級沉淀。但是當鹽濃度繼續(xù)升高，并超過某一上限時，其溶解度又會先后以不同速度下降，分別“鹽析(salting out)沉淀析出。 ? 性質(zhì) 方法 ? 分子大小 離心，超離心法、凝膠過濾， 膜分離技術(shù)（超濾，反滲透， 微孔過濾，透析，電滲析等） ? 溶解度 鹽析法，有機溶劑沉淀法，共沉淀法， 選擇性沉淀法，結(jié)晶 ? 電荷或基團 離子交換色譜，電泳，等電聚焦， 吸附 色譜，疏水色譜，聚焦色譜 ? 穩(wěn)定性 選擇性變性法（熱，酸堿， 表面活性劑） ? 特殊（專一性結(jié)合） 親和色譜，親和洗脫，親和電泳 酶的分離純化方法 ? 根據(jù)溶解度不同進行的純化 ? 按分子大小進行的純化 ? 根據(jù)電學解離性質(zhì)不同進行的純化 ? 利用專一親和作用進行的純化 ? 根據(jù)穩(wěn)定性差別建立的純化方法 根據(jù)溶解度不同進行的純化 ? 鹽析法 ? 有機溶劑沉淀法 ? 共沉淀法 ? 選擇性沉淀法 ? 等電點沉淀法 ? 液液分離法 一、鹽析法 ? 鹽析法是最古老的，但也是目前仍廣泛采用的方法。 ? 經(jīng)過初步提純，余下來的大分子為酶與雜蛋白，分離純化的主要工作，同時也是比較困難的工作，就是將酶從雜蛋白中分離出來。必要時使用核酸酶。 ? pH緩沖劑 通常以選用 pH4~6為佳 ? 溫度效應劑 (如甘油，二甲亞砜 ) ? 蛋白酶抑制劑（如 PMSF苯甲磺酰氯， DIFP二異丙基氟磷酸） ? 防氧化劑 (如巰基乙醇） ? 重金屬絡合劑（如 EDTA， 檸檬酸） ? 增溶劑（如 TritonX100,去氧膽酸鹽） 濃縮與初步提純 ? ? 抽提液和發(fā)酵液中的酶的濃度一般都很低，所以在純化前往往須先加以濃縮。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。抽提液的具體組成和抽提條件取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。 ? 抽提的要求是將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料引入溶液。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。 丙酮干粉的制備 ? 破細胞等處理后可將材料制成丙酮干粉 (acetone powder)， 一般程序是： ? 先將材料粉碎、分散，然后在 0℃ 以下的低溫條件下，加入 5~10倍預先冷至約 20 ℃ 的丙酮，迅速攪拌均勻，隨即過濾，最后低溫干燥，研磨過篩。 ? 將細胞在一定的 pH值和適宜的溫度條件下保溫一段時間，通過細胞本身存在的酶系將細胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法稱為自溶法。 ? β葡聚糖酶用于酵母細胞的破碎。 ? ? 根據(jù)細胞外層結(jié)構(gòu)特點，選用適當?shù)拿?，使細胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細胞破裂。 ? 表面活性劑處理對膜結(jié)合酶的提取特別有效，在實驗室和生產(chǎn)中均已成功使用。 （ 2）表面活性劑處理 ? 表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。 （ 1）有機溶劑處理 ? 有機溶劑可使細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。 Fig. Sonicator 化學破碎法 ? 這是應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或破壞的方法。但對 G+菌不適用。 ? 此法適用于膜結(jié)合的酶、細胞間質(zhì)酶等的提取。 ? 應用時先將對數(shù)生長期的細胞從培養(yǎng)液中分離出來，再懸浮在 20%左右的蔗糖溶液中平衡一段時間，然后離心收集細胞，迅速投入 4℃ 左右的蒸餾水或低滲溶液中。 ? 突然降壓法的另一種形式為爆破性減壓法是將菌體懸浮在高壓容器中，用氮氣或二氧化碳加壓到幾十至幾百大氣壓，振蕩幾分鐘，使氣體擴散到細胞內(nèi)，然后突然排出氣體，壓力驟降，使細胞破碎。沖擊壓力可達每平方厘米幾百至幾千 kg。常用的有高壓沖擊、突然降壓和滲透壓差法等。但難以應用于工業(yè)化生產(chǎn)。 ? 例如將冷凍的細胞突然放進較高溫度的水中，或?qū)⑤^高溫度中的細胞突然冷凍都可使細胞破壞。 物理破碎法 ? 通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法，統(tǒng)稱為物理破碎法。通常用來破碎那些易于分散，比較柔軟，顆粒細小的組織細胞。 ? 此法效率較低 機械破碎法 ? ? 利用勻漿器所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。 10000r/min ? 此法在實驗室和生產(chǎn)規(guī)模均可采用。 ? 對一個方法好壞的評價標準是： ? ? 材料選擇及其前處理 ? 動物材料：事先剔除結(jié)締組織、脂肪組織 ? 植物材料：果實種子事先去皮殼，油質(zhì)種子用乙醚等脫脂 ? 微生物發(fā)酵物：先將菌體和發(fā)酵物分離 ? 胞外酶 酶 胞內(nèi)酶 結(jié)酶 溶酶 細胞破碎 除了動植物體液中的酶和微生物胞外酶之外，大多數(shù)酶都存在于細胞內(nèi)，因此提取和分離純化前須將進行細胞的破碎。 、有機溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應予以足夠的重視。 本章主要內(nèi)容 ? 酶的提取、純化的基本原則 ? 細胞破碎 ? 酶的抽提 ? 濃縮與初步提純 ? 酶的分離純化方法 ? 酶的純化步驟 ? 酶純化步驟的定量評價 ? 酶的提純標準及劑型 11. 酶的提取、分離純化 酶的提取、分離純化是將酶從細胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的、要求相適應的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程 ? 酶的提取包括以下內(nèi)容： ? 材料的選擇及前處理 ? 破細胞 ? 抽提 ? 濃縮與初步提純 酶的提取、純化的基本原則 一、防止變性失效 二、可以采用比一般蛋白質(zhì)分離更多更有效的方法和條件 三、提取、純化的每一步都應進行酶活力的檢測 ? 采用的方法應兼顧酶的回收和提高酶產(chǎn)品的比活力 注意點 ，所有操作都應在低溫下條件下進行，尤其在有有機溶劑存在時更應特別小心 2. 大多數(shù)酶在 pH4或 pH 10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個系統(tǒng)不要過酸或過堿；同時要避免在調(diào)節(jié) pH時產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。11 酶的提取與分離純化 暨南大學食品科學與工程系 包惠燕 食品酶學 包惠燕 11 思考題 ? ？ ? ？ ? 中為什么要破細胞？破細胞的方法有哪些？其中哪些可用于大規(guī)模生產(chǎn)？ ? ？ ? 異？分別有哪些主要的分離方法？ ? 6. SDSPAGE指什么？試述其原理和應用。 ? ，畫出示意圖。 ，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應盡量減少泡沫形成。 酶分離純化的工藝流程設計 設計時需要考慮的因素： ? 酶源材料 ? 前期工藝過程 ? 產(chǎn)品對純度的要求 ? 酶存在的狀態(tài) ? 設備條件 ? 動力、原料成本及工時費用 酶分離純化的工藝流程設計 ? 合理的工藝應以降低成本，提高效能，同時又提高產(chǎn)品純度和質(zhì)量為前提。 破碎細胞的方法有 : 機械法，物理法，化學法和酶法 機械破碎法 ? 指通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力使細胞破碎的方法，常用的有如下幾種： ? ? 利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。 ? ? 利用研缽、石磨、球磨 (不銹鋼或玻璃珠直徑 )、細菌磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎，必要時可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化鋁等作為助磨劑。勻漿器一般由硬質(zhì)磨砂玻璃制成，也可由硬質(zhì)塑料可不銹鋼等制成。 ? 此法細胞破碎程度較高，對酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應用。此法多用于微生物細胞的破碎 ? 通過溫度的突然變化使細胞破碎。 ? 此法對較脆弱的細胞效果較好。 ? 通過壓力的變化使細