質(zhì)粒dna限制性酶切圖譜分析-展示頁
2024-10-15 15:57本頁面
【正文】 ? 第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶 也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位臵上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶在 DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析 DNA結(jié)構或克隆基因。 ? 根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型三大類。一、 DNA的限制性酶切實驗原理 實驗三 質(zhì)粒 DNA限制性酶切圖譜分析 ? 核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。 ? 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５ ’ 端為Ｐ，３ ’ 端為ＯＨ。 ? 第一類（ I型）限制性內(nèi)切酶 能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割 DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類酶如 EcoB、 EcoK等。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此也不能應用于基因克隆。 ? 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發(fā)展。 如 EcoRI的識別順序為： 5’…… G|AATTC …… 3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在雙鏈上交錯切割的位臵切割后生成 5’…… G AATTC…… 3’ 3’…… CTTAA G…… 5’ 各有一個單鏈末端 ， 二條單鏈是互補的 ， 其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過 DNA連接酶的作用而 “ 粘合 ” 。例如 EcoRV 的識別位臵是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 這種末端同樣可以通過 DNA連接酶連接起來。 ? 用一個字母代表菌株或型 ， 如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用 d， 即 Hind。 2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法 一、 DNA的限制性酶切實驗原理 由 pUC18改造而來，大小為 3162bp 。 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。 二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理 瓊脂糖凝膠電泳法分離 DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 EB可與 DNA分子形成 EBDNA復合物，其熒光強度與 DNA的含量成正比。 二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理 （ 1）瓊脂糖含液體量大，可達 9899%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。 （ 3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。 瓊脂糖電泳的優(yōu)點 ?配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。此步操作是整個實驗成敗的關鍵 ,要防止錯加，漏加。 （ 2）、混勻反應體系后 ,將 eppendorf管臵于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?,37℃ 水浴保溫 1小時 ,使酶切反應完全。 瓊脂糖凝膠電泳 (1) 稱取 ，臵 25ml電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解； (2)待溶液冷至 60℃ ，加入 2ul SYBR Green I。加入TAE緩沖液使恰好沒過膠面約 1mm； (5)將 DNA樣品 與 1
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