質(zhì)粒dna限制性酶切圖譜分析-展示頁(yè)
2024-10-15 15:57本頁(yè)面
【正文】 ? 第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶 也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位臵上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶在 DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析 DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。 ? 根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型三大類。一、 DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒 DNA限制性酶切圖譜分析 ? 核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來(lái)ＤＮＡ的侵襲。 ? 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５ ’ 端為Ｐ，３ ’ 端為ＯＨ。 ? 第一類（ I型）限制性內(nèi)切酶 能識(shí)別專一的核苷酸順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割 DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。這類酶如 EcoB、 EcoK等。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。 ? 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。 如 EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋? 5’…… G|AATTC …… 3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在雙鏈上交錯(cuò)切割的位臵切割后生成 5’…… G AATTC…… 3’ 3’…… CTTAA G…… 5’ 各有一個(gè)單鏈末端 ， 二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的 ， 其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò) DNA連接酶的作用而 “ 粘合 ” 。例如 EcoRV 的識(shí)別位臵是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 這種末端同樣可以通過(guò) DNA連接酶連接起來(lái)。 ? 用一個(gè)字母代表菌株或型 ， 如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用 d， 即 Hind。 2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法 一、 DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)原理 由 pUC18改造而來(lái)，大小為 3162bp 。 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。 二、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖凝膠電泳法分離 DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。 EB可與 DNA分子形成 EBDNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與 DNA的含量成正比。 二、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理 （ 1）瓊脂糖含液體量大，可達(dá) 9899%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小。 （ 3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定。 瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn) ?配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵 ,要防止錯(cuò)加，漏加。 （ 2）、混勻反應(yīng)體系后 ,將 eppendorf管臵于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?,37℃ 水浴保溫 1小時(shí) ,使酶切反應(yīng)完全。 瓊脂糖凝膠電泳 (1) 稱取 ，臵 25ml電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解； (2)待溶液冷至 60℃ ，加入 2ul SYBR Green I。加入TAE緩沖液使恰好沒(méi)過(guò)膠面約 1mm； (5)將 DNA樣品 與 1
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