ecoli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定-資料下載頁
2025-01-05 02:56本頁面
【正文】 EcoR I U dd H2O ?L 10 ?L 1U: 1單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下， 在 20 ?L 反應(yīng)液中反應(yīng) 1h，使 1 ?g DNA完全消化所需的酶量 . 輕輕混勻 , 4000g離心 10秒 ，置于 37℃ 水浴中酶解 。 酶解完成后，加入 ?l 10 上樣緩沖液 (或 2 ?l 6 上樣緩沖液 ), 混勻 . 稱取 1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入 100mL TBE或 1 TAE緩沖液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。 將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至 60℃ 左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴 EB， 小心混勻 ，倒到制膠槽上，直到在整個有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層， 不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為 3～ 4mm） ； 室溫下靜置 30min左右，待凝固完全后， 輕輕拔出梳子 。 制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有 TBE或 1 TAE緩沖液的電泳槽中使用 (注意 :電泳槽中的緩沖液應(yīng)與配膠用的緩沖液成分、濃度一致 )。 用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳（ 80～ 100V的電壓下電泳，一般情況下， 電壓 /電極間距離應(yīng)小于5V/cm），當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿約 1cm處停止電泳。 在紫外燈 (310nm波長 )下觀察染色后的凝膠。 DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶 (在紫外燈下觀察時，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷 ，拍照電泳圖譜時，可采用凝膠成象系統(tǒng) )。 五 . 實(shí)驗結(jié)果報告： 轉(zhuǎn)化效率的計算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積 /涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率 （ 每微克質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù) ） ＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)（個轉(zhuǎn)化子） /加入質(zhì)粒 DNA的量（ μg） 質(zhì)粒提取與酶切鑒定結(jié)果，貼上打印實(shí)驗照片并標(biāo)明照片上各 DNA條帶的含義。 六、思考題： 何謂感受態(tài)細(xì)胞？制備感受態(tài)細(xì)胞的理論依據(jù)是什么？ 為什么通常使用 RM菌作為基因工程受體菌？ 簡述 CaCl2制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化的基本原理。 根據(jù) DNA限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為幾種類型？其中 II類限制性內(nèi)切酶有何特性？ 在用堿裂解法小量制備質(zhì)粒過程中 I液、 II液與III液的作用機(jī)理是什么？ 簡述堿裂解法小量制備質(zhì)粒的原理。
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