堿裂解法從ecoli中制備質(zhì)粒dna-資料下載頁(yè)
2025-05-15 01:23本頁(yè)面
【正文】 DS法 。 細(xì)菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓 ， 減輕細(xì)菌裂解時(shí) DNA泄漏過(guò)快產(chǎn)生的機(jī)械剪切力 。 ? 在溶菌酶消化細(xì)菌壁與膜后 ， 再加 SDS解聚蛋白質(zhì)與 DNA的結(jié)合 。 ? 整個(gè)操作中物理剪切力小， 適用于大分子量的質(zhì)粒 DNA的提取。 3．細(xì)菌染色體 DNA變性條件強(qiáng)弱的控制 ? 堿法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常用的質(zhì)粒DNA提取方法 。 它對(duì)細(xì)菌的裂解 ， 細(xì)菌染色體 DNA及蛋白質(zhì)變性充分 ， 所以提取的質(zhì)粒 DNA產(chǎn)量高純度好 。 ? 但是暴露在強(qiáng)堿性環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ， 共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA可發(fā)生不可逆的變性 ， 導(dǎo)致內(nèi)切酶切割困難 ， 質(zhì)粒 DNA遷移速度降低 1倍左右 ， EB染色效率低 。 ? 1966年 Vinograd等人對(duì)這個(gè)問(wèn)題作過(guò)報(bào)道 ， 但目前 ， 仍有些實(shí)驗(yàn)人員 ， 對(duì)這一關(guān)鍵問(wèn)題并沒(méi)有足夠的重視 。 如出現(xiàn)這種狀況 ， 在下次提取時(shí) ， 可以適當(dāng)縮短堿變性時(shí)間 ， 不必按某些書(shū)籍中規(guī)定的 10分鐘時(shí)間操作 ． ? ? 在煮沸法中 ， 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間 ， 過(guò)高熱度也會(huì)導(dǎo)致類似問(wèn)題的出現(xiàn) ， 這種影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的操作細(xì)節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進(jìn) 。 4．細(xì)菌的培養(yǎng)與收集 ? 細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，也會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量和內(nèi)切酶酶解效果。所以離心收集細(xì)菌時(shí)，上清液應(yīng)去除干凈，最好用 STE或生理鹽水再懸浮，漂洗菌體 12次。 （四）堿裂解法原理 ： ? 在 ， 線性的大分子量細(xì)菌染色體 DNA變性 ， 而共價(jià)閉環(huán) (CC)質(zhì)粒 DNA仍為自然狀態(tài) 。 ? 將 pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下 ， 染色體 DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。 大部分 DNA和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS的作用下形成沉淀 ， 而 CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài) 。 ? 通過(guò)離心 ， 可去除大部分細(xì)胞碎片染色體 DNA、 RNA及蛋白質(zhì) ， 質(zhì)粒 DNA尚在上清中 ， 再用酚 、 氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA。 問(wèn)題： ? １ ） 有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí) ，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割 ， 這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠 。 ? 大多數(shù)情況下 ， 用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量制備物中的雜質(zhì) 。如果依然存在 ， 可用離心柱層析法純化ＤＮＡ 。 ? ２ ） 在十分偶然的情況下 ， 個(gè)別小量制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒ＤＮＡ的現(xiàn)象 。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去 。
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