堿裂解法從ecoli中制備質粒dna-資料下載頁
2025-05-15 01:23本頁面
【正文】 DS法 。 細菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓 ， 減輕細菌裂解時 DNA泄漏過快產(chǎn)生的機械剪切力 。 ? 在溶菌酶消化細菌壁與膜后 ， 再加 SDS解聚蛋白質與 DNA的結合 。 ? 整個操作中物理剪切力小， 適用于大分子量的質粒 DNA的提取。 3．細菌染色體 DNA變性條件強弱的控制 ? 堿法是目前實驗室中最常用的質粒DNA提取方法 。 它對細菌的裂解 ， 細菌染色體 DNA及蛋白質變性充分 ， 所以提取的質粒 DNA產(chǎn)量高純度好 。 ? 但是暴露在強堿性環(huán)境中時間過長 ， 共價閉合環(huán)狀質粒 DNA可發(fā)生不可逆的變性 ， 導致內切酶切割困難 ， 質粒 DNA遷移速度降低 1倍左右 ， EB染色效率低 。 ? 1966年 Vinograd等人對這個問題作過報道 ， 但目前 ， 仍有些實驗人員 ， 對這一關鍵問題并沒有足夠的重視 。 如出現(xiàn)這種狀況 ， 在下次提取時 ， 可以適當縮短堿變性時間 ， 不必按某些書籍中規(guī)定的 10分鐘時間操作 ． ? ? 在煮沸法中 ， 過長時間 ， 過高熱度也會導致類似問題的出現(xiàn) ， 這種影響實驗結果的操作細節(jié)應根據(jù)具體的菌株和質粒情況加以適當改進 。 4．細菌的培養(yǎng)與收集 ? 細菌生長過程中的代謝廢物和脫落的細胞壁成分，也會影響到質粒的質量和內切酶酶解效果。所以離心收集細菌時，上清液應去除干凈，最好用 STE或生理鹽水再懸浮，漂洗菌體 12次。 （四）堿裂解法原理 ： ? 在 ， 線性的大分子量細菌染色體 DNA變性 ， 而共價閉環(huán) (CC)質粒 DNA仍為自然狀態(tài) 。 ? 將 pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下 ， 染色體 DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構 。 大部分 DNA和蛋白質在去污劑 SDS的作用下形成沉淀 ， 而 CC質粒DNA仍然為可溶狀態(tài) 。 ? 通過離心 ， 可去除大部分細胞碎片染色體 DNA、 RNA及蛋白質 ， 質粒 DNA尚在上清中 ， 再用酚 、 氯仿抽提進一步純化質粒 DNA。 問題： ? １ ） 有些工作者首次進行小量制備時 ，有時會發(fā)現(xiàn)質粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割 ， 這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠 。 ? 大多數(shù)情況下 ， 用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量制備物中的雜質 。如果依然存在 ， 可用離心柱層析法純化ＤＮＡ 。 ? ２ ） 在十分偶然的情況下 ， 個別小量制備物會出現(xiàn)無質粒ＤＮＡ的現(xiàn)象 。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去 。
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