質(zhì)粒dna的提取、純化和電泳檢測-資料下載頁
2025-07-07 15:50本頁面
【正文】 緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在渦旋振蕩器上劇烈振蕩，否則，染色體DNA會斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分利用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。之后的實(shí)驗(yàn)操作是將菌液在4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)。上清液中含有大量RNA、斷裂的DNA片段和質(zhì)粒DNA。注意此時(shí)沉淀不實(shí)，寧愿少吸上清，也不要帶入沉淀，因?yàn)閹氲某恋碓谥蟛僮髦袩o法去除。在使用離心機(jī)時(shí)，樣品放置要對稱平衡，否則會嚴(yán)重?fù)p害離心機(jī)的使用壽命。沉淀DNA通常使用預(yù)冷無水乙醇，在低溫條件下長時(shí)間放置可使DNA沉淀完全。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。TE溶液是pH緩沖液，含有10mM TrisHCl（pH ）、1mM EDTA，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)。同時(shí)TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。RNase A是一種廣泛應(yīng)用的核糖核酸內(nèi)切酶，專一性催化CU間3’5’磷酸二酯鍵的裂開形成具有2’,3’環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸，可以去除殘留的RNA。寡聚核糖核苷酸會保存在質(zhì)粒DNA溶液中，但不影響后續(xù)的常規(guī)操作。質(zhì)粒DNA中蛋白質(zhì)的去除通常采用酚、氯仿抽提。質(zhì)粒DNA純化過程中使用酚/氯仿/異戊醇混合液。苯酚是強(qiáng)的蛋白阻斷劑，可使蛋白變性析出。同時(shí)，此時(shí)DNA分布于水相而RNA分布于有機(jī)相，從而可分離上清獲得DNA。，且與水有很大的互溶性，即酚可以進(jìn)入水相從而影響后續(xù)的酶反應(yīng)。因此，需要使用氯仿。氯仿也是蛋白阻斷劑，但強(qiáng)度弱于苯酚，其主要作用是將同水以極小比例互溶的苯酚萃取出來。如果不加氯仿，殘留的苯酚會阻礙酶切反應(yīng)等，且不利于獲得含質(zhì)粒的水相。加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，使水相和有機(jī)相間的界面更清晰，從而便于回收質(zhì)粒DNA。采用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)效果較單獨(dú)用酚或氯仿好，但需要抽提多次。質(zhì)粒DNA溶解子在上層的水相中。在實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要注意，酚有強(qiáng)烈的腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心并且戴手套操作。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過長，否則溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。對于瓊脂糖溶液來說，如果膠液溫度過高，會使制膠板、制膠槽、樣品梳變性，從而影響膠孔大小和膠形狀，間接影響加樣量和跑條帶。如果膠液溫度過低，瓊脂糖凝膠會凝固，所以在膠液冷卻至60℃左右倒膠。膠液冷卻至60℃左右后需要加EB，EB是一種強(qiáng)烈的誘變劑，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。制膠的時(shí)候要除去氣泡。膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄壞點(diǎn)樣。拔梳子的時(shí)候要特別小心，以防凝膠與支持物脫離。電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳效果。配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時(shí)使用的緩沖液為同一批配制的。注意使電泳槽中1TAE緩沖液高于瓊脂糖凝膠約1mm。DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動，因此點(diǎn)樣孔在負(fù)極。電泳上樣時(shí)要小心操作，槍尖應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。同時(shí)不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。跑多個(gè)樣時(shí)，應(yīng)依次快速點(diǎn)樣，否則時(shí)間一久，樣品會彌散。瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA過程中使用上樣緩沖液（loading buffer），其含有30%甘油、%溴酚藍(lán)（BPB）、%二甲苯青FF。甘油的作用是增大樣品密度，確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)。溴酚藍(lán)及二甲苯氰作為雙色電泳指示劑，使樣品呈現(xiàn)顏色，了解樣品泳動情況，使加樣操作更為便利，另外可以在電場中預(yù)測速率。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因此，該法還可用于相對分子質(zhì)量的測定。將未知相對分子質(zhì)量的DNA樣品與已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可以獲得該樣品的相對分子質(zhì)量的大小。紫外線對眼睛和皮膚均有危害性，對眼睛尤甚。為了最大限度避免受到輻射，要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡（眼罩）或能夠有效阻擋紫外線的全副完全罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。參考文獻(xiàn)[1] ：北京大學(xué)出版社，2009年.寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來越容易。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。能干的人，不在情緒上計(jì)較，只在做事上認(rèn)真；無能的人！不在做事上認(rèn)真，只在情緒上計(jì)較。拼一個(gè)春夏秋冬！贏一個(gè)無悔人生！早安！—————獻(xiàn)給所有努力的人.學(xué)習(xí)好幫手
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