【正文】 將未知相對(duì)分子質(zhì)量的DNA樣品與已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀察其遷移距離，就可以獲得該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小。膠液冷卻至60℃左右后需要加EB，EB是一種強(qiáng)烈的誘變劑，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。質(zhì)粒DNA純化過(guò)程中使用酚/氯仿/異戊醇混合液。冰浴使反應(yīng)更充分。葡萄糖還可以防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。在pUC19 DNA對(duì)應(yīng)的條帶位置上可以看到模糊的DNA條帶，產(chǎn)生的原因是因?yàn)橄旅娴腄NA條帶中有些DNA因?yàn)檫w移速度較慢而使DNA條帶拉長(zhǎng)。在圖1中，可以看到泳道2與泳道17對(duì)應(yīng)的電泳圖中有一條清晰明亮的DNA條帶。④啟動(dòng)電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開(kāi)。①配制2L1TAE：取40mL 50TAE，用雙蒸水將其稀釋至2L。 堿裂解/變性法提取質(zhì)粒DNA（1）取出一支滅菌的100mL離心管，標(biāo)記上組號(hào)，用天平稱量其重量，并記錄為W1。（3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細(xì)菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性分析。堿變性提取法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。常見(jiàn)的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。（6）每100mg菌體量，加入（按菌體量接近的重新分組，溶液Ⅰ補(bǔ)平）：①Ⅰ，充分渦旋振蕩，用溶液Ⅰ再次配平；②Ⅱ，輕柔顛倒混勻，冰浴3～5min；③Ⅲ，輕柔顛倒混勻，冰浴5min。（2）電泳上樣。在溶液中，由于DNA核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在泳道3與泳道16對(duì)應(yīng)的DNA帶中，圖中上面那條較細(xì)較暗的條帶是HindⅢ酶切后的pUC19，圖中下面那條較粗較亮的條帶是沒(méi)有被HindⅢ酶切的pUC19。某些點(diǎn)樣孔的邊緣（尤其是下邊緣）出現(xiàn)熒光，泳道泳道泳道泳道12等對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣孔下邊緣可明顯觀察到此現(xiàn)象。加入溶液Ⅱ時(shí)，菌液變黏稠、透明，無(wú)菌塊殘留。注意此時(shí)沉淀不實(shí)，寧愿少吸上清，也不要帶入沉淀，因?yàn)閹氲某恋碓谥蟛僮髦袩o(wú)法去除。氯仿也是蛋白阻斷劑，但強(qiáng)度弱于苯酚，其主要作用是將同水以極小比例互溶的苯酚萃取出來(lái)。配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時(shí)使用的緩沖液為同一批配制的。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來(lái)越容易。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA過(guò)程中使用上樣緩沖液（loading buffer），其含有30%甘油、%溴酚藍(lán)（BPB）、%二甲苯青FF。在實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要注意，酚有強(qiáng)烈的腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心并且戴手套操作。TE溶液是pH緩沖液，含有10mM TrisHCl（pH ）、1mM EDTA，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)。溶液Ⅱ中的SDS遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀（PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。加入溶液Ⅰ后溶液變渾濁，可劇烈振蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂。在pUC19對(duì)應(yīng)的DNA條帶位置處全班10個(gè)組均無(wú)明顯的DNA條帶。此DNA 溶液中已含有1Loading Buffer，可直接上樣。①開(kāi)啟電泳儀電源 。（12）分次加入1mL TE溶液并轉(zhuǎn)移到EP管中，得質(zhì)粒DNA粗提物。不同大小DNA片段的相對(duì)電泳遷移率在4～30℃內(nèi)無(wú)變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，％時(shí)凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個(gè)因素：（1）樣品DNA分子的大?。弘娪緯r(shí)，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對(duì)數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α＃ɑ騈aAc）高鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA、堿變性提取法、質(zhì)粒DNA的純化、DNA凝膠電泳質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。核酸在溶液中由于磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。（6）溫度：DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的行為受堿基組成和凝膠溫度影響不明顯。（11）重復(fù)70%乙醇洗滌一次，37℃風(fēng)干5～10min。（3）凝膠電泳與DNA分離。每次取6μL電泳時(shí)，每條帶的DNA量約為50 ng，其中5 kbp條帶的DNA量約為其他條帶的3倍（150ng），顯示亮帶。另外泳道11對(duì)應(yīng)的電泳圖中也可以看到一條較暗的pUC19 DNA條帶。溶液Ⅰ中含有50mM葡萄糖、25mM TrisHCl（pH ）、10mM EDTA。加入溶液Ⅲ時(shí)，會(huì)