質(zhì)粒dna限制性酶切圖譜分析-資料下載頁(yè)
2024-10-09 15:57本頁(yè)面
【正文】 1. 減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶 2. 減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶 ?問(wèn)題六：電泳后 DNA片段的帶型彌散，不均一 原因 對(duì) 策 五、 限制性內(nèi)切酶酶切 常見問(wèn)題分析 1. 含磷酸鹽的濃度高 2. 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 3. 平末端連接 4. 外切酶污染 5. 連接緩沖液不合適 1. 透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 2. 延長(zhǎng)滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收 DNA 3. 加大 T4 DNA Ligase用量 4. 減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收 DNA 5. 重新配制連接緩沖液 七、 DNA電泳常見問(wèn)題分析 ?問(wèn)題七：酶切后的 DNA片段連接效率低 原因 對(duì) 策 1. DNA降解 2. 電泳緩沖液陳舊 3. 所用電泳條件不合適 4. DNA上樣量過(guò)多 5. DNA樣含鹽過(guò)高 6. 有蛋白污染 7. DNA變性 1. 避免核酸酶污染 2. 電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低， pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液 3. 電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò) 20V/cm，溫度＜ 30℃ ；巨大 DNA鏈電泳，溫度應(yīng)＜ 15℃ ；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力 4. 減少凝膠中 DNA上樣量 5. 電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽 6. 電泳前酚抽提去除蛋白 7. 電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋 DNA 七、 DNA電泳常見問(wèn)題分析 ?問(wèn)題一： DNA帶模糊 原因 對(duì) 策 1. 對(duì)于 λ/ Hind III片段 cos位點(diǎn)復(fù)性 2. 電泳條件不合適 3. DNA變性 1. 電泳前于 65℃ 加熱 DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻 5分鐘 2. 電泳電壓不超過(guò) 20V/cm；溫度＜30℃ ；經(jīng)常更換電泳緩沖液 3. 以 20mM NaCl Buffer稀釋 DNA，電泳前勿加熱 ?問(wèn)題二：不規(guī)則 DNA帶遷移 對(duì) 策 原因 七、 DNA電泳常見問(wèn)題分析 1. DNA的上樣量不夠 2. DNA降解 3. DNA走出凝膠 4. 對(duì)于 EB染色的 DNA，所用光源不合適 1. 增加 DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低 2. 避免 DNA的核酸酶污染 3. 縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度 4. 應(yīng)用短波長(zhǎng)（ 254nm）的紫外光源 ?問(wèn)題三：帶弱或無(wú) DNA帶 對(duì) 策 原因 七、 DNA電泳常見問(wèn)題分析 1. 小 DNA帶走出凝膠 2. 分子大小相近的 DNA帶不易分辨 3. DNA 變性 4. DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適 1. 縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度 2. 增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度 3. 電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋 DNA 4. 在脈沖凝膠電泳上分析 ?問(wèn)題四： DNA帶缺失 對(duì) 策 原因 七、 DNA電泳常見問(wèn)題分析 八、問(wèn)題與討論 1. 在整個(gè)酶切反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？ 2. 反應(yīng)體系中為何內(nèi)切酶用量不能超過(guò)整個(gè)反應(yīng)體系的 10％？ 3. 在酶切緩沖液中加入牛血清白蛋白（ BSA）的目的與機(jī)理是什么？ Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker
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