限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法-資料下載頁
2025-01-18 06:43本頁面
【正文】 S以及過量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。，所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。(ph, 溫度)和底物用量，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。，以免污染酶液，同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。℃或需長時(shí)間保溫時(shí)，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。：①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng)(如連接，切割等)，可將反應(yīng)管置65℃保溫2030分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作。19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時(shí)請(qǐng)查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。二、限制性酶解中常見的問題及解決措施：限制性酶切割DNA底物的操作過程中，會(huì)出現(xiàn)一些問題，產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非最佳狀態(tài)，包括DNA的純度和特性，反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積、反應(yīng)時(shí)間及溫度等。問題原因解決辦法DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割1) 內(nèi)切酶失活標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性2) DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA3) 條件不適（試劑、溫度）檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳4) DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm，dam基因型的細(xì)菌菌株5) DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增6) DNA位點(diǎn)上存在其它修飾將DNA底物與λDAN混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證7) DNA不存在該酶識(shí)別順序換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證DNA切割不完全1) 內(nèi)切酶活性下降用510倍量過量消化2) 內(nèi)切酶稀釋不正確用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶3) DNA不純，反應(yīng)條件不佳同上4) 內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上反應(yīng)前離心數(shù)秒6) 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積7) 酶切后DNA粘末端退火電泳前將樣品置65℃保溫510分鐘，取出后置冰浴驟冷8) 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩9) 過度稀釋使酶活性降低適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏10)反應(yīng)條件不適使用最佳反應(yīng)體系11)識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序加大酶量510倍DNA片段數(shù)目多于理倫值1) 內(nèi)切酶星狀活性檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量2) 其它內(nèi)切酶污染用λDNA作底物檢查酶切結(jié)果3) 底物中含其它DNA雜質(zhì)電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段酶切后沒有觀察到DNA片段的存在1) DNA定量錯(cuò)誤（如RNA含量較高）用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活1) 保存溫度不合適內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在20℃低溫保存2) 以稀釋形式保存稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用3) 貯藏緩沖液不適當(dāng)使用廠家推薦的貯藏緩沖液4) 低蛋白濃度內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一1) DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)電泳前上樣液65℃加熱5min，%的SDS，酚/氯仿抽提純化2) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶酶切后的DNA片段連接效率低1) 含磷酸鹽的濃度高透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽2) 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶延長滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端連接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收DNA5) 連接緩沖液不合適重新配制
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