限制性內(nèi)切酶酶切的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法(編輯修改稿)
2025-02-14 06:43 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 如其它的DNA、其它的內(nèi)切酶或DNA酶等。感謝amberly戰(zhàn)友的支持和提議, 尤其感謝wht5945戰(zhàn)友對(duì)“內(nèi)切酶熱失活溫度”、“星號(hào)活性”以及“酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基”等內(nèi)容的補(bǔ)充與整理。wht5945戰(zhàn)友的帖子除了補(bǔ)充和整理外，還具有獨(dú)立參考的價(jià)值。他的寶帖見(jiàn)：限制性內(nèi)切酶的熱失活：內(nèi)切酶星號(hào)活性：限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基：進(jìn)37度之前，用vortex或移液槍混一下是否更好一些，能把壁上的液體旋掉!但注意槍頭不要盡量沾帶上溶液，減少體系損失！限制性內(nèi)切酶的熱失活熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡(jiǎn)便易行的方法。大多數(shù)最適反應(yīng)溫度是37℃的酶在65℃下溫育20分鐘即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃，溫育20分鐘也可失活。下表注明了每種酶的失活條件。在50μl的反應(yīng)體系中，37℃條件下，加入510μl內(nèi)切酶及相應(yīng)緩沖液，反應(yīng)60分鐘，然后升溫至65℃或 80℃溫育20分鐘進(jìn)行熱失活。（通常為λDNA），調(diào)節(jié)溫度至最適反應(yīng)溫度，溫育60分鐘。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或完全被消化，則表明該酶沒(méi)有完全被熱失活。下面附上一些酶熱失活的溫度表內(nèi)切酶星號(hào)活性在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號(hào)活性。有人提出，這種星號(hào)活性可能是內(nèi)切酶的一種普遍特性（1），如果提供給相應(yīng)反應(yīng)條件，所有內(nèi)切酶都會(huì)出現(xiàn)非特異性切割。NEB已證實(shí)下列酶存在星號(hào)活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。酶識(shí)別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號(hào)活性的反應(yīng)條件影響。常見(jiàn)的引起酶識(shí)別改變的條件有：?jiǎn)螇A基替換、識(shí)別序列外側(cè)堿基縮短以及單鏈切刻（10）。Polisky等（4）對(duì)EcoR I的早期研究表明，在低鹽濃度、高pH值條件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等（11）的研究表明，只要識(shí)別中心的四堿基序列（AATT）不出現(xiàn)A/T替換，EcoR I可以切割其它任何單堿基替代序列。大多數(shù)星號(hào)活性是可以控制的，做酶切反應(yīng)時(shí)一般不考慮這方面的因素。只要在正常條件下，使用隨酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性。下面列出了導(dǎo)致或抑制星號(hào)活性的因素。導(dǎo)致星號(hào)活性的因素：1.較高的甘油濃度（5% v/v）；2.酶與底物DNA比例過(guò)高（不同的酶情況不同，通常為100 U/amp。micro。g）；3.低鹽濃度（25 mM）4.高pH值（pH ）5.存在有機(jī)溶劑（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）6.用其他二價(jià)離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I對(duì)甘油濃度更敏感，而后者則對(duì)高pH值更敏感一些(2)。抑制星號(hào)活性的方法：1.盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過(guò)度消化以及過(guò)高的甘油濃度。2.盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時(shí)引入的乙醇）的污染。3.將離子濃度提高到100150 mM（若酶活性不受離子強(qiáng)度影響）。限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基:限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基，這些堿基對(duì)內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。保護(hù)堿基常見(jiàn)于PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，為保護(hù)5` 端外加的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使酶切完全而添加。其次，在分子克隆時(shí)，選擇載體的酶切位點(diǎn)也會(huì)碰到，相臨的2個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過(guò)少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。保護(hù)堿基的具體設(shè)計(jì)可以可以看圖:我有點(diǎn)不明白，上圖是檢測(cè)內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù)，怎么能作為保護(hù)堿基的設(shè)計(jì)用呢？我設(shè)計(jì)引物是隨機(jī)設(shè)計(jì)保護(hù)堿基也切得很好呀？望樓主及戰(zhàn)友們賜教的確，上圖是檢測(cè)內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)不僅考慮到末端堿基數(shù)量的影響，同時(shí)還考慮到了末端堿基組成對(duì)酶切效率的影響，唯一存在推敲的是，這些數(shù)據(jù)是使用“寡核苷酸”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。也就是說(shuō)，保護(hù)性堿
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