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正文內(nèi)容

限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法(編輯修改稿)

2025-02-14 06:43 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 如其它的DNA、其它的內(nèi)切酶或DNA酶等。感謝amberly戰(zhàn)友的支持和提議, 尤其感謝wht5945戰(zhàn)友對“內(nèi)切酶熱失活溫度”、“星號活性”以及“酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基”等內(nèi)容的補(bǔ)充與整理。wht5945戰(zhàn)友的帖子除了補(bǔ)充和整理外,還具有獨(dú)立參考的價(jià)值。他的寶帖見:限制性內(nèi)切酶的熱失活:內(nèi)切酶星號活性:限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基:進(jìn)37度之前,用vortex或移液槍混一下是否更好一些,能把壁上的液體旋掉!但注意槍頭不要盡量沾帶上溶液,減少體系損失!限制性內(nèi)切酶的熱失活熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡便易行的方法。大多數(shù)最適反應(yīng)溫度是37℃的酶在65℃下溫育20分鐘即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃,溫育20分鐘也可失活。下表注明了每種酶的失活條件。在50μl的反應(yīng)體系中,37℃條件下,加入510μl內(nèi)切酶及相應(yīng)緩沖液,反應(yīng)60分鐘,然后升溫至65℃或 80℃溫育20分鐘進(jìn)行熱失活。(通常為λDNA),調(diào)節(jié)溫度至最適反應(yīng)溫度,溫育60分鐘。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或完全被消化,則表明該酶沒有完全被熱失活。下面附上一些酶熱失活的溫度表內(nèi)切酶星號活性在非理想的條件下,內(nèi)切酶切割與識別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列,這一現(xiàn)象稱星號活性。有人提出,這種星號活性可能是內(nèi)切酶的一種普遍特性(1),如果提供給相應(yīng)反應(yīng)條件,所有內(nèi)切酶都會出現(xiàn)非特異性切割。NEB已證實(shí)下列酶存在星號活性:Apo I(2)、Ase I(2)、BamH I(3)、BssH II(2)、EcoR I(4)、EcoR V(5)、Hind III(1)、Hinf I(7)、Pst I(8)、Pvu II(9)、Sal I(8)、Sca I(2)、Taq I(10)、Xmn I(2)。酶識別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號活性的反應(yīng)條件影響。常見的引起酶識別改變的條件有:單堿基替換、識別序列外側(cè)堿基縮短以及單鏈切刻(10)。Polisky等(4)對EcoR I的早期研究表明,在低鹽濃度、高pH值條件下,EcoR I可能切割N/AATTN序列;最近,Gardner等(11)的研究表明,只要識別中心的四堿基序列(AATT)不出現(xiàn)A/T替換,EcoR I可以切割其它任何單堿基替代序列。大多數(shù)星號活性是可以控制的,做酶切反應(yīng)時(shí)一般不考慮這方面的因素。只要在正常條件下,使用隨酶提供的NEBuffer,NEB的酶就不會出現(xiàn)星號活性。下面列出了導(dǎo)致或抑制星號活性的因素。導(dǎo)致星號活性的因素:1.較高的甘油濃度(5% v/v);2.酶與底物DNA比例過高(不同的酶情況不同,通常為100 U/amp。micro。g);3.低鹽濃度(25 mM)4.高pH值(pH )5.存在有機(jī)溶劑(如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等)6.用其他二價(jià)離子替代鎂離子(如Mn++,Cu++,Co++,Zn++等)以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I對甘油濃度更敏感,而后者則對高pH值更敏感一些(2)。抑制星號活性的方法:1.盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。2.盡量避免有機(jī)溶劑(如制備DNA時(shí)引入的乙醇)的污染。3.將離子濃度提高到100150 mM(若酶活性不受離子強(qiáng)度影響)。限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基:限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白還要占據(jù)識別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基,這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的,被稱為保護(hù)堿基。保護(hù)堿基常見于PCR引物設(shè)計(jì)時(shí),為保護(hù)5` 端外加的內(nèi)切酶識別位點(diǎn),使酶切完全而添加。其次,在分子克隆時(shí),選擇載體的酶切位點(diǎn)也會碰到,相臨的2個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用,因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。保護(hù)堿基的具體設(shè)計(jì)可以可以看圖:我有點(diǎn)不明白,上圖是檢測內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù),怎么能作為保護(hù)堿基的設(shè)計(jì)用呢?我設(shè)計(jì)引物是隨機(jī)設(shè)計(jì)保護(hù)堿基也切得很好呀?望樓主及戰(zhàn)友們賜教的確,上圖是檢測內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)不僅考慮到末端堿基數(shù)量的影響,同時(shí)還考慮到了末端堿基組成對酶切效率的影響,唯一存在推敲的是,這些數(shù)據(jù)是使用“寡核苷酸”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。也就是說,保護(hù)性堿
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