堿裂解法從ecoli中制備質(zhì)粒dna(編輯修改稿)
2025-06-20 01:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 1. pBR322 ? pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長為 4 363bp，由 3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來自 pRSF2124， tetr來自 pSCl01，復(fù)制起始點來自 pM9。核苷酸的序次號，以 EcoRI序列 GAATTC的第一個 T為第一個核苷酸。 2. pUC系統(tǒng) ? 如 pUCl8和 pUCI9，由 pBR322的 ampr基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分 1acZ基因和一個多種限制性內(nèi)切酶單一位點的接頭構(gòu)成，全長 2 666bp， pUCl8和 pUCl9所含多位點接頭的方向正好相反。 3．表達載體 ? 載體含有 tac啟動子 、 Lac操縱基因 、SD序列 、 Lac I阻遏蛋白基因等 。 四、質(zhì)粒 DNA的提取和純化 （一）、 質(zhì)粒提取的主要步驟 1．細菌的培養(yǎng)： ? 先分離單個菌落， 接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒 DNA也在自主復(fù)制。 ? 對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體 DNA的復(fù)制。質(zhì)粒 DNA的復(fù)制不受影響而大量擴增。 ? 對于新一代的質(zhì)粒如 pUC系列等，由于宿主對這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴(yán)，利用氯霉素對質(zhì)粒 DNA的選擇性擴增并不十分必要。 ? 長時間在氯霉素存在下 ， 質(zhì)粒 DNA合成過程中 ， 復(fù)制鏈中會摻入核糖核苷酸 ， 對堿性條件敏感 ， 將會導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 ． ? 但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴增質(zhì)粒 ， 其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量 。 而且細菌量的減少 ， 使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低 ， 操作更方便 、 有效 ， 對煮沸法更是如此 。 所以使用氯霉素的主要目的 ， 是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下 ， 減少細菌的培養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量 ． ? 有時質(zhì)粒在細菌中的擴增狀況很差 ， 常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致 。 ? 這種低效率擴增 ， 可利用高營養(yǎng)培養(yǎng)基促進生長 ， 一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量 46倍 。 2．細菌的收集與裂解 ? 細胞生長過程中 ， 排出大量代謝產(chǎn)物 ，為了提高質(zhì)粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ，細菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ，漂洗 l2次 ， 離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈 。 ? 細胞的裂解方法很多 ， 如去污劑法 ， 沸水熱裂法 、 堿變性法 ， 有機溶劑法和溶菌酶法等 。 ? 不同方法各有利弊，一
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