[醫(yī)學(xué)]chapter5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增dna(編輯修改稿)
2025-01-30 23:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 A樣品溶解于水中（不含 EDTA）。 PCR結(jié)果疑難問(wèn)題分析 3. 在 陰性對(duì)照 中擴(kuò)增出目的條帶。 原因： 盛模板 DNA的器具或溶解模板 DNA的溶液污染所致。 對(duì)策： （ 1） 重新清潔所用器具。 （ 2）重新提取模板 DNA，溶解模板 DNA的溶液不能有污染。 （ 3）重做整個(gè) PCR試驗(yàn)。 PCR結(jié)果疑難問(wèn)題分析 4. 擴(kuò)增產(chǎn)物呈明顯的分子質(zhì)量錯(cuò)誤的條帶。 原因： 根據(jù)一條或兩條引物的非特異性引導(dǎo)。 對(duì)策： （ 1） 縮短復(fù)性時(shí)間或增加復(fù)性溫度。 5. 擴(kuò)增目的產(chǎn)物 DNA呈現(xiàn)模糊的廣泛的成片條帶。 原因： 引物二聚體所致或模板 DNA過(guò)量。 對(duì)策：檢查引物是否均一、模板 DNA序列內(nèi)是否存在高度重復(fù)序列，優(yōu)化每條獨(dú)立引物的濃度。 應(yīng)用降落 PCR或熱啟動(dòng) PCR降低模板的量。 PCR結(jié)果疑難問(wèn)題分析 PCR結(jié)果疑難問(wèn)題分析 PCR結(jié)果疑難問(wèn)題分析 2. 制備克隆用 PCR產(chǎn)物的純化 問(wèn)題： PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后不能順利地克隆到由相同酶切的載體上。 原因： PCR產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法純化后， DNA樣品中還殘留一些具有酶活性的 TaqDNA聚合酶或其它熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶以及一些 dNTP。 DNA聚合酶會(huì)填平由限制酶消解產(chǎn)生的 3’凹端。 制備克隆用 PCR產(chǎn)物的純化方法 1. 集中 8支 PCR反應(yīng)管的反應(yīng)液約 400μl，內(nèi)含目的基因擴(kuò)增片段 1μg。 2. 加 5 蛋白酶 K緩沖液和終濃度至50μg/ml的蛋白酶 K。溫育反應(yīng)混合液在 37℃ 水浴 60min。 3. 用 75℃ 水浴 20min加熱滅活蛋白酶 K。 4. 反應(yīng)混合液用酚氯仿與氯仿各抽提一次。 5. 用乙醇沉淀法回收 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。 制備克隆用 PCR產(chǎn)物的純化方法 6. 用微量離心機(jī)于 4℃ 高速離心 5min，回收沉淀下來(lái)的 DNA，小心棄去上清，用 1ml 70%乙醇于室溫洗滌沉淀的樣品，再次離心樣品，棄去上清，使乙醇揮發(fā)殆盡。 7. 將沉淀下來(lái)的 DNA樣品溶于 TE，一般推測(cè)擴(kuò)增DNA樣品的回收率在 50%80%。 8. 可取純化后的 DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算 DNA樣品的實(shí)際含量。 3. 克隆化的 PCR產(chǎn)物連入 T載體 T載體有與 A堿基互補(bǔ)的未配對(duì) 3’T堿基。 T載體可用以下三種方法構(gòu)建： 1. 可用限制性內(nèi)切核酸酶如 XcmI、 HphI與 MboII酶切產(chǎn)生 3’末端未配對(duì) T堿基。 2. 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧 TTP加入一個(gè)突出的 T殘基到線性化載體的 3’末端。 3. 應(yīng)用不依賴于模板的 Taq DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在線性化載體的 3’末端處的羥基基團(tuán)上催化連接上一個(gè) T堿基。 克隆化的 PCR產(chǎn)物連入 T載體的方法 1. 在一只微量離心管內(nèi)，依次加入下列連接混合液 PCR擴(kuò)增的目的 DNA 3 μl T載體 10 連接緩沖液 1 μl 噬菌體 T4DNA連接酶 1 μl 用 H2O補(bǔ)足至 10 μl 2. 將連接混合液在 14℃ 溫育 4h。 3. 取連接反應(yīng)后的混合液適量，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。 克隆化的 PCR產(chǎn)物連入 T載體的方法 4. 將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有抗生素、 IPTG和 Xgal的固體培養(yǎng)平板上。 5. 過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取白色菌落，進(jìn)行培養(yǎng)。 6. 提取質(zhì)粒 DNA。 7. 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行酶切鑒定，或用PCR進(jìn)行鑒定。 8. 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定克隆 DNA片段的大小。 9. 通過(guò)測(cè)序來(lái)分析 PCR擴(kuò)增片段的正確性。 4. 通過(guò) PCR擴(kuò)增在擴(kuò)增 DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 用于 PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物的 5’末端常被設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。 擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段的雙末端被引入新的酶切位點(diǎn)經(jīng)酶切消化后的擴(kuò)增片段能定向克隆至相應(yīng)的載體。 用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化純化后的擴(kuò)增片段與載體連接，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，即可完成克隆。 通過(guò) PCR擴(kuò)增在擴(kuò)
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