聚合酶鏈反應(yīng)word版(編輯修改稿)
2025-02-03 18:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 二．引物的設(shè)計后檢查 設(shè)計好的一對引物并非就是合理的，應(yīng)該對其進(jìn)行進(jìn)一步分析。由于在實(shí)際工作中，欲擴(kuò)增模板的條件不同以及實(shí)驗(yàn)的 最終目的的不同，對引物的要求可能不一樣。有時已知條件很難滿足設(shè)計“合理”引物的要求。但在引物設(shè)計中應(yīng)盡量考慮到下列因素。 1．長度 寡核昔酸引物長度一般為 15～ 30bp， 常用的是 1827 bp引物的有效長度： In＝ 2(G十 C)十 (A 十 T)，引物過短會影響到擴(kuò)增的特異性，引物過長至有效長度 In 值＞38 時，反應(yīng)系統(tǒng)的最適延伸溫度會超過 TaqDNA 聚合酶最適反應(yīng)溫度（ 74℃）， （ [2] 林萬明著 . PCR 技術(shù)操作與應(yīng)用指南 . 北京 :人民軍醫(yī)出版社 ,1993.） 也無法保證產(chǎn)物的特異性。如果擴(kuò)增產(chǎn)物≤ 500bp，引物長度為 16～ 18bp 即可。若擴(kuò)增產(chǎn)物為 4～ 5kb，引物最好不要少于 24bp。引物 3’末端應(yīng)含有所研究基因特異序列中的 17～ 30bp。 2．堿基分布的均衡性。 引物中各種堿基最好分布均勻， G 十 C/A+T 應(yīng)為 50％左右， G 十 C 含量一般為40％ — 60％。引物中應(yīng)避免嘌呤或嘧啶的堆積現(xiàn)象，避免連續(xù)出現(xiàn) 4 個以上的同一堿基，尤其 3’端不應(yīng)超過 3 個連續(xù)的 G 或 C，因這樣會使引物在 G 十 C 富集序列區(qū)發(fā)生錯誤引發(fā)。 （ [2] 林萬明著 . PCR 技術(shù)操作與應(yīng)用指南 . 北京 :人民軍醫(yī)出版社 ,1993.） 3．引物的 Tm 值。 當(dāng)溫度升高到一定值后，雙鏈 DNA 分子會解鏈為單鏈，這種溫度稱為解鏈溫度（ melting temperature,Tm）。 Tm 值是指溶液中有半數(shù)的 DNA 分子解鏈為單鏈時的溫度。引物容易復(fù)性到模板上的溫度（退火溫度）是 Tm 值減去 510℃，所以 Tm 值直接關(guān)系到 PCR 循環(huán)系統(tǒng)退火溫度的選擇。如果退火溫度過低，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈不易解鏈，難以繼續(xù)碰撞找到正確的配對模板，故復(fù)性的特異性降低。如果退火溫度過高，則利于變性而不利于復(fù)性。太高的退火溫度使得引物復(fù)性到模板上，故不能有效地啟動 DNA 的合成。若按公式 Tm＝ 4 (G 十 C)十2 (A 十 T)估計引物的 Tm 值，則有效引物的 Tm 為 55— 80℃，其 Tm 值最好接近 72℃以使復(fù)性條件最佳。兩條引物的 Tm 值盡可能相同，相差最好不要超過 3℃。 4. 引物二聚體。 由于一般的 DNA 聚合酶在低溫下仍具有活性，因此常規(guī) PCR 中反應(yīng)混合物內(nèi)引物與模板及引物自身可以部分發(fā)生非特異性復(fù)性，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增及引物二聚體／多聚體的形成。二聚體可在兩個不同的引物分子之間形成，也可在兩個相同的引物分子之間形成，因此，在引物設(shè)計時，應(yīng)盡可能地減少兩引物分子之間或一引物分子內(nèi) 部有過多的互補(bǔ)堿基，尤應(yīng)避免 3’端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成，否則就會形成二聚體。二聚體分子中的兩條鏈互為模板，互為引物，引起引物擴(kuò)增，導(dǎo)致模板擴(kuò)增失敗。一對引物間不應(yīng)多于 4 個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 另外在實(shí)際操作中， PCR 反應(yīng)的熱啟動 (hot
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