dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述(存儲版)
【正文】 切點，可接受 20kb左右的外源片段，可用于基因組 DNA文庫構(gòu)建。一個典型的 YAC系列載體v 病毒載體 DNA病毒在細胞中具有較高的拷貝數(shù)，并有較強的啟動子，因而是基因工程載體的理想候選者。 EBV病毒的順式作用因子 oriP可以在帶有 EBV DNA并表達具有反式作用的 EBNA－ 1抗原的貼壁細胞中維持附加體DNA分子的存在，因而能作為構(gòu)建表達載體的元件，該類載體也主要用于建立帶有多拷貝外源基因的細胞系。B 1個字母或阿拉伯數(shù)字代表菌株（ EcoR、 Hind）C 1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序（ EcoRI、 Hind III ）限制性內(nèi)切酶的分類按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素限制性內(nèi)切酶可劃分為三大類：I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復(fù)合體。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進化過程中各自獨立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識異切酶消化星號活力限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端： 鈍性末端 (blunt end) 粘性末端 (sticky end)同尾酶有時兩種酶切割序列 不完全相同 ，但卻能產(chǎn)生 相同的粘性末端 ，這類酶被稱為 同尾酶 ，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。因此 , 盡量采用規(guī)范的實驗步驟 , 應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（ 339。使用時的緩沖液濃度應(yīng)為 1X。注意：不可振蕩！反應(yīng)溫度 大部分酶的反應(yīng)溫度為 37℃ ；從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。少部分酶則須在 70℃ 長期保存。C） 10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的 1/10； 10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。v擴大酶催化反應(yīng)的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋。載體多位環(huán)狀 DNA,如果只有一個酶切位點，用單酶切。 E. coli DNA 連接酶催化 DNA分子連接的機理與 T4噬菌體 DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是 ATP而是NAD+。多數(shù)情況是變成平末端，這可通過 DNA酶降解，或 DNA聚合酶不平的方式解決。 一般外源片段較載體摩爾濃度高 ， 5： 1。但 37℃ 時粘性末端分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即12~16℃ 。對于 T4噬菌體 DNA連接酶的活性測定至少有三種以上的方法：DNA重組 —— 連接DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點來確定。Company: TAKARA Fermentas 連接酶（ ligase)v主要有兩種： T4噬菌體 DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。 雙酶切時要先分析兩種酶且的條件，根據(jù)兩種酶切的緩沖液要求，有三種情況兼 容 性 處 理完全兼容 同時加 2種酶進行酶切完全不兼容 先用一種酶切，沉淀洗鹽，再用另一種酶切相對兼容 （其中一種酶活性相對較低）同時加 2種酶進行酶切只是鹽離子濃度不同先用低離子要求的酶切，再補加酶和鹽。應(yīng)最后加酶。如果有抑制劑存在（通常是鹽、 EDTA或酚），則混合物里的對照DNA也無法被切開使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟A）測試酶切 DNA的量B）計算完全酶切所需的酶量。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。 DNA 待切割的 DNA應(yīng)當已去除酚、氯仿、乙醇、 EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。比如，酶切 1ug lambdaDNA，需要 12單位的酶，而酶切 1ug質(zhì)粒 DNA，需要 35單位的酶。同裂酶限制性內(nèi)切酶在非標準反應(yīng)條件下 ,也能切割一些與其特異識別序列類似的序列。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應(yīng)的修飾酶則需要 S甲硫氨酸腺苷的存在。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三種 限制性內(nèi)切酶中 唯一用于 DNA分析和克隆的一類 。阿爾伯 (Arber)、史密斯 (Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲 1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎限制性內(nèi)切酶的特點：限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如 PvuII（ 157個氨基酸），也可以比 1250個氨基酸的 CjeI更大除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)在已純化分類的 3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過 250種的特異識別序列。v ColE1復(fù)制起始位點，使質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制擴增。 主要用于真核基因的克隆 , 基因組文庫構(gòu)建 : 產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。 5. 可人工加入多克隆位點 。 對克隆后的 PCR產(chǎn)物使用 M13 primers進行 DNA測序。 Hind III。（單拷貝或多拷貝：緊密型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒）? 嚴緊型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。質(zhì)粒 (Plasmid)質(zhì)粒是獨立于宿主細胞（如細菌）染色體之外的可進行復(fù)制和遺傳的遺傳單位 雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋 DNA分子 。DNA重組操作過程載體外源 DNA片段外源 DNA插入剪切引入宿主細胞a b bA重組A b抗性篩選重組篩選重組質(zhì)粒構(gòu)建： 目的 DNA的 PCR擴增 DNA片段和載體的 酶切 片段 DNA與載體的 連接載體： plasmid（ primary）工具酶：限制性內(nèi)切酶 連接酶
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1