【正文】 .................................................................. 13 參 考 文 獻(xiàn) ......................................................................................... 14 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 1 1 引言 動(dòng)物 防御素的概述 在動(dòng)物 體內(nèi) 發(fā)現(xiàn)了一組具有抗菌作用的多肽 , 稱之為抗菌肽。它們參與了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活動(dòng) , 是內(nèi)源免疫體系成分。 目前 已 經(jīng) 從動(dòng)物和植物中分離純化出 200 種以上的多肽。 抗菌肽 是一種分子量少于 100 個(gè)氨基酸殘基的多肽，它主要兩大家族組成， 防御素 （ defensins） 和 cathelicidins，它們廣泛存在于哺乳 動(dòng)物 的潘氏細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi) 。 20 世紀(jì) 80 年代中期 , Ganz 研究組在研究吞噬細(xì)胞非依賴氧殺菌機(jī)制過(guò)程中 ， 兔和人中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中發(fā)現(xiàn)一系列一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的小分子陽(yáng)離子肽 , 由于其廣譜的抗微生物活性而首次以 防御素 一詞作為這類肽的命名 [1,2]。 動(dòng)物 防御素是富含精氨酸殘基的陽(yáng)離子多肽 , 成熟 肽形式其 分子量～ 6 kDa, 通常 含 有 六 個(gè)保守的半胱氨酸殘基 [3]， 在動(dòng)物體內(nèi)以一種含有 β折疊和 6 個(gè)半胱氨酸形成的 3 對(duì)二硫鍵框架的抗菌肽， 二硫鍵 有利 于 使 防 御素 保持 穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)， 而 且 還 是 其 抗微生物活性 及 細(xì)胞毒效應(yīng)的 主 要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) [45]。依 其 3 對(duì)二硫鍵形成的方式的不同，防御素可分為， α防御素、 β防御素 、 θ防御素 3 類 。 β防御素 1991 年 Diamond 首次從牛的氣管內(nèi)發(fā)現(xiàn)了另外一種防御素，其分子內(nèi)同樣也含有 6 個(gè)保守的半胱氨酸殘基 , 但是這 6 個(gè)保守的半胱氨酸形成的三個(gè)二硫鍵的連接方式則不同于 α防御素 , 因此將基命名為 β防 御素 [6]。 β－防御素由 38~42 個(gè)氨基酸殘基組成 ， 6 個(gè)半胱氨酸殘基配對(duì)形成 3 對(duì)二硫鍵，連接位置分別為： CyslCys Cys2Cys Cys3Cys6 [7]，并且在 β防御素 序列中部有 1 個(gè)保守的脯氨酸和 1 個(gè)甘氨酸， 是 α－防御素所不具有的 。 β防御素的信號(hào)序列和前體序列是一樣的， β防御素由于具有分子質(zhì)量相對(duì)較小且具有明顯的半胱氨酸排列的特征使其對(duì)于詳述和維持此類分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要意義。研究已證實(shí)雞、山羊、綿羊防御素與牛的 β防御素具有顯著的同源性，這些宿主防御素在進(jìn)化上保守 。 在綿羊體內(nèi)要有兩種 β防御素存在， SBD1 和 SBD2，通過(guò) RTPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) SBD1 存在于氣管和整個(gè)消化道 （ 從舌到結(jié)腸 ） 中，而 SBD2 則只存在于舌和遠(yuǎn)端回腸 [8]。 動(dòng)物 β防御素 是帶正電荷的，具有兩性的（ 親水性和疏水性結(jié)構(gòu)） ，此結(jié)構(gòu)使得動(dòng)物 β防御素 與生物膜相互作用的方式為， 陽(yáng)離子域 接 近 生物膜的 帶負(fù)電的磷脂 凸起，而與此同時(shí)動(dòng)物 β防御素的疏水部分被 隱藏于由 疏水鏈脂肪酸組成的膜的內(nèi)部 ，從而使細(xì)胞膜表面形成孔洞，細(xì)菌內(nèi)外離子濃度相同，導(dǎo)致細(xì)菌死亡 [9]。也就是，由于防御素分子帶正電荷呈 即陽(yáng)性，能夠與呈陰性帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜表面通過(guò)靜電吸引而相互結(jié)合，合后其分子中的疏水區(qū)與菌體膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)結(jié)合，后插入到細(xì)菌的細(xì)胞膜， 其帶正電區(qū)則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電的磷脂頭2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1 的構(gòu)建 部及水分子相互作用 [1012]。在細(xì)胞膜上單個(gè)或群體的防御素形成孔隙或通道， 得在正常情況下在細(xì)菌體外的離子、多肽等流入到菌體內(nèi)，而菌體 內(nèi)重要的鹽類、大分子等跑到菌體外，從而使細(xì)菌的膜失去了保護(hù)作用，最終導(dǎo)致不可逆的 菌體死亡。 防御素的應(yīng)用前景 由于 防御素特殊的抗性機(jī)理 , 即主要作用于病原微生物的細(xì)胞膜 , 使病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性 。 可以避免 重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生抗 藥性 。同時(shí)， 防御素還具有十分廣泛的抗性譜 , 可抗細(xì)菌、真菌、有囊膜病毒 ，甚至對(duì)支原體、衣原體、螺旋體及一些惡性細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞） 和艾 滋病病毒也有殺傷作用。因此， 可將防御素 作為或替代 抗生素發(fā)揮其強(qiáng)效、廣譜的抗微生物感染的作用 ， 從而為解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題提供新的方法。并且 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們把 防御素 基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入微生物的表達(dá)系統(tǒng)， 或直接將 防御素 基因?qū)嘶騽?dòng)物體內(nèi)表達(dá)，可明顯提高動(dòng)物的抗病能力和傳染病防治 [13]。 畢赤酵母表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 酵母是低等真核生物，具有細(xì)胞生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物時(shí)表達(dá)時(shí)對(duì)蛋 白質(zhì)進(jìn)行正確加工 、修飾 合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺 乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。 許多無(wú)脊椎動(dòng)物和植物防御素已 經(jīng)在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)，并且 人的 β 防 御 素已 在 巴 斯德 畢 赤 酵母 中 得 到 成功 表 達(dá) [14,15] 。 畢 赤 酵母（ ） 為 甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母 ， 在甲醇為主的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng) , 并達(dá)到很高的濃度。 畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn) ： （ 1） 具有 醇氧化酶 AOX1 基因 啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的 啟動(dòng) 子之一。 （ 2） 質(zhì) 粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。 （ 3） 菌株 易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。 （ 4） 畢赤酵母 中存在過(guò)氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。 畢赤酵母 基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子 AOX1，已高效表達(dá)了 HBsAg、 TNF、 EGF、 破傷風(fēng)毒素 C 片段、基因工程抗體等多種外源基因 ，證實(shí)該系統(tǒng)為高效、實(shí)用、簡(jiǎn)便，以提高表達(dá)量 并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜于 擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模 [16]。 選取質(zhì)粒 pPIC9K 的優(yōu)點(diǎn) 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 3 畢赤 酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，所以 需 要 表達(dá)載體與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá) 。 巴斯德畢赤酵母 表達(dá)外源蛋白 的方式可分為： 胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外 表達(dá) 兩種方式 [17,18]。 pPIC9K 屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在 原核表達(dá) 。 pPIC9K 含卡那基因 （ 圖 1） , 從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數(shù)。而且用于分泌表達(dá) ， 分泌重組蛋白至培養(yǎng)基中。 圖 1： pPIC9K 質(zhì)粒圖譜 研究?jī)?nèi)容 基于本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒 PUC57mSBD1T，利用 PCR 技術(shù)，擴(kuò)增mSBD1 基因。擴(kuò)增出的 mSBD1 基因與 T 載體成功連接后，將其亞克隆到畢赤酵母表達(dá)載 pPIC9K 上 ，構(gòu) 建真核表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1。 存在的問(wèn)題 β防御素 是小分子肽 ， 小分子肽易于受 蛋白酶 （ 多在中性 pH 條件下產(chǎn)） 的影響 ， 這時(shí)可以用非緩沖培養(yǎng)基 ， 由于隨著畢赤酵母在非緩沖培養(yǎng)基中的不斷表達(dá) ， pH 降 到 3 或更低 ,使得許多中性 pH 蛋白酶失活 ，而且 畢赤酵母能在低 pH 生長(zhǎng) 。 另外 ，有 報(bào)道 表明 在 pH 的緩沖培養(yǎng)基中加 1% 的 Casamino acids 可以抑制細(xì)胞外蛋白酶 ,使得鼠表皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)量提高 [19]。 還可以用確定最佳發(fā)酵時(shí)間來(lái)減少蛋白酶的水解作用 ,使產(chǎn)出時(shí)間比達(dá)到最佳 。 pPIC9K