【正文】 VM 的ELISA 試劑盒的組裝與應用奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ： 馬鈴薯 M 病毒； CP 基因；原核表達； 重組 CP；抗血清制備 2 Preparation of antiserum against rebinant coat protein of potato virus M Student majoring in biotechnology Liu Yang Tutor Guo Baotai Abstract: The rebinant bacterium strain BL21(pET22bPVM) was induced by IPTG, a 36KD specific protein band was found in the SDSPAGE pattern of total protein, its size was the same as expected, the result showed that the prokaryotic expression of CP gene of potato virus M (PVM) was successful. Total cellular protein of the rebinant bacterium was extracted by lysozyme method and then the PVM rebinant CP was purified with nickel iron affinity chromatography column. Antiserum was prepared by injection of rabbits with the highpurity rebinant CP. Indirect ELISA detection indicated that the titer of the antiserum was 1:64K. Positive reaction was observed between the prepared antiserum and PVM positive sample in IDELISA. The antiserum prepared in this research has the ability to detect the PVM. In this research, high titer antiserum of PVM was prepared by the use of rebinant CP, it has laid the foundation for the ELISA detection of PVM, and also laid the foundation for the assembly and application of ELISA detection kit for PVM. Key words: potato virus M。 coat protein (CP) gene。 prokaryotic expression。 rebinant CP。 preparation of antiserum 3 引言 馬鈴薯 (Solanum tuberosum L.)是茄科茄屬的一年生草本植物，食用部分為塊莖。馬鈴薯是非常重要的糧、菜兼用作物。 馬鈴薯在我國的種植范圍較廣， 但對于單位面積的產(chǎn)量而言， 卻與馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)達的國家有一定的差距 。 導致這種局面的重要原因之一就是病毒積累引起的種薯退化，這在很大程度上限制了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 [1]。 馬鈴薯 滿足人們對經(jīng)濟作物的各種要求 ，同時它 可以加工成各種 工業(yè) 產(chǎn) 品，使用及其廣泛 。遺傳上馬鈴薯是同源四倍體的作物，雖然可以有性繁殖，但 一般利用塊莖進行無性繁殖。 常規(guī) 育種技術(shù)用于馬鈴薯會遇到 諸多問題與困難。另外，采用常規(guī)的雜交育種方法改良馬鈴薯品種效率低，過程復雜而且所花費的時間很長。 馬鈴薯病毒能夠?qū)е埋R鈴薯品種退化，具體表現(xiàn)是既影響馬鈴薯的產(chǎn)量，也會造成質(zhì)量的嚴重下降 [2]。馬鈴薯病毒嚴重制約了馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)化，當發(fā)生復合侵染時，產(chǎn)量損失更高。馬鈴薯病毒病的種類繁多， 在我國 已 發(fā)現(xiàn) [10 種以上 的病毒，其中 常見的馬鈴薯病毒主要 就 有六種 [3]。 馬鈴薯 M病毒 ( Potato virus M, PVM )是香石竹潛隱病毒屬（ Carlavirus）成員，它的基因組為正單鏈 RNA病毒 [4]。基因組序列中有 6個 ORFs，另外 5’端有長度為75個核苷酸非編碼區(qū)， 3’端有 70個核苷酸的 poly(A)[5]。其中外殼蛋白（ CP）是由第三個編碼序列中的一個 ORF編碼的，其大小約為 34kDa[5]。 PVM通過接觸傳病，分布范圍廣，可造成大面積減產(chǎn)。 目前為止，防治馬鈴薯病毒，減少其危害的最有效途徑是使用無毒種薯。通過莖尖剝離與培養(yǎng)擴繁，可以獲得大量無毒（脫毒）試管苗，并可 進一步獲得脫毒微型薯與種子。病毒脫除難度與效果，因病毒種類不同而異， PVM的脫除就比較困難。對脫毒材料進行嚴格地檢測與篩選，才能獲得真正的脫毒材料，進一步保障生產(chǎn)上脫毒種薯的增產(chǎn)效果。 植物病毒檢測方法可以歸納為三大類：生物實驗法，基于核酸的分子檢測方法及免疫學（血清學）方法 [6]。 馬鈴薯病毒檢測的方法很多，但用于馬鈴薯種苗病毒檢測的方法要求迅速、廉價 、無誤 。 基于核酸的分子檢測方法是在 PCR反應基礎(chǔ)上建立起來的檢測技術(shù)， PCR方法特異性好，靈敏度高 。 但是該法對儀器 4 和操作人員要求較高，不太合適 于現(xiàn)場診斷 。 生產(chǎn)上適合于對大量樣品進行的檢測的主要方法是酶聯(lián)免疫吸附（ ELISA）法。 ELISA檢測法仍然是國際馬鈴薯中心認可的馬鈴薯病毒檢測的最基本方法。獲得純化的特異性抗體及酶標記抗體是有效開展 ELISA檢測的關(guān)鍵。檢測中可用肉眼或比色法判斷測定結(jié)果。 ELISA 用于檢測馬鈴薯病毒始于 Caspe對馬鈴薯卷葉病毒 (PLRV)的檢測，認為用 ELISA 技術(shù)進行 PLRV 的常規(guī)鑒定是可行的 [7]。免疫學方法的靈敏度高、特異性強、技術(shù)步驟比較簡單、 能夠?qū)?大量田間樣品 進行 檢測。 ELISA仍然是 當 前生產(chǎn)應用最 方便 、最廣泛的檢測 技術(shù)。 大量 產(chǎn) 出高效價的抗血清是免疫學方法應用的關(guān)鍵。在經(jīng)典的方法中，馬鈴薯病毒抗血清制備的抗原是提純病毒粒子。但是 用這種方法 制備抗血清存在很多弊端。 有 些病毒在 宿 主 的 含量 少 ，難以獲得足夠的 純化后的 抗原。還有一些病毒純 化 困難，不易得到純化的病毒粒 子 。 由于病毒粒子制備的困難，導致國產(chǎn)馬鈴薯病毒抗血清非常缺乏，明顯影響了其應用。 利用 分子生物學技術(shù) 可以解決經(jīng)典方法中遇到的 抗原（馬鈴薯病毒粒子）制備困難 問題。 具體方法就是利用原核表達的重組 CP作抗原制備出馬鈴薯病毒抗血清。 研究表明 可以 利用重組 CP途徑（基因工程途徑） 來 制備檢測馬鈴薯病毒抗血清。但目前未見馬鈴薯重組 CP抗血清（抗體）用于大量樣品 ELISA檢測的報道，也未見重組 CP多克隆抗體用于組裝 ELISA檢測試劑盒的報道，相關(guān)的研究有待深入。 Cerovska[8]等克隆了 PVM的 CP基因并制備了重組 CP的抗血清 ，且成功用于Wsetern分析。國內(nèi)未見 PVMCP基因原核表達的研究。 本研究目的是利用重組 CP 制備出 PVM 高效價的抗血清，為實現(xiàn)基于重組CP 多克隆抗體的 DASELISA 檢測技術(shù)的建立奠定基礎(chǔ)，同時也為 PVM 抗血清及 ELISA 檢測試劑盒的國產(chǎn)化與大量生產(chǎn)提 供技術(shù)保障。 本研究的具體的研究內(nèi)容是： 1）誘導重組菌 BL21(pET22bMCP)中 PVMCP基因的表達。 2）提取并溶解包涵體、