【正文】 ... 14 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 1 1 引言 動(dòng)物 防御素的概述 在動(dòng)物 體內(nèi) 發(fā)現(xiàn)了一組具有抗菌作用的多肽 , 稱之為抗菌肽。 可以避免 重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生抗 藥性 。 pPIC9K 含卡那基因 （ 圖 1） , 從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數(shù)。 PCR 反 應(yīng)條件： 94 ℃ 預(yù)變性 5 min → 35 個(gè) PCR 循環(huán) ： 94 ℃ 變性 30 s，51 ℃退火 30 s， 72 ℃ 延伸 30 s。 表 5 連接反應(yīng)體系 成分 Ingredients 加樣體積 , Sample volume, μL pPIC9K 10T4 Ligase buffer T4 DNA Ligase（ 3U/μL） mSBD1 滅菌蒸餾水 總體積 total 10 （ 5） 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 在 100 μL 感受態(tài)大腸桿菌 DH5α 中加 10 μL 連接產(chǎn)物 pPIC9KmSBD1，混勻后冰浴 30 min， 42 ℃ 熱休克 90 s，再冰浴 2 min；加入 500 μL無(wú)抗性 LB 培養(yǎng)基 37 ℃ 搖菌 45min；取 100 mL 轉(zhuǎn)化菌液涂布于含 Amp LB 培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜 。 但目前關(guān)于防御素生物學(xué)功能的研究還多為體外實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)只有在轉(zhuǎn)化為動(dòng)物模型的體內(nèi)研究后，才能反映防御素在人類疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 天然的防御素蛋白抗菌譜非常廣泛 ， 而轉(zhuǎn)基因防御素的抗菌活性往往較差 , 提高轉(zhuǎn)基因防御素的生物學(xué)活性， 其原因有待進(jìn)一步研究。 表 4 EcoR I+Not I 酶切體系 成分 Ingredients 加樣體積 , Sample volume, ?L mSBD1/ pPIC9K 18 QuickCut? EcoR I 2 QuickCut? Not I 2 10QuickCut Buffer 3 滅菌 H2O 2 總體積 total 30 引物 序列 Primer Sequence（ 5′→3′ ） 5′ mSBD1 CGGAATTCAGATTGTCCTGTCAC 3′ mSBD1 ATAGTTTAGCGGCCGCTTATCTACAACACTTAACTGGTGG 8 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1 的構(gòu)建 （ 3） 酶切產(chǎn)物分別膠回收 ① 將單一的目的 DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中在紫外燈下切下，放入干凈的離心管中加入 3 倍體積的溶膠液 PN， 50 ℃ 水浴放置 10 min，其間溫和的翻動(dòng)離心管，確保膠塊充分溶解； ② 將膠塊溶解液加入一個(gè)吸附柱中，室溫靜置 2 min，然后 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液； ③ 向吸附柱中加入 600 μL 漂洗液 PW， 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液； ④ 重復(fù)步驟 ③ ； ⑤ 將吸附柱離心 12,000 rpm， 2 min，室溫放置數(shù)分鐘，徹底的晾干； ⑥ 將吸附柱安置于新的 mL 的離心管上，在吸附柱膜的中央處加入 30 μL 的滅菌蒸餾水，室溫靜置 2 min； 12,000 rpm 離心 2 min，離心管中的溶液即為 DNA 回收溶液。 方法 綿羊 β防御素 1 成熟肽 （ mSBD1） 基因的克隆 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù) NCBI 報(bào)道的 綿羊 β防御素 1（ SBD1： u75250） 成熟肽序列 ， 設(shè)計(jì) mSBD1 真核表達(dá)產(chǎn)物的引物，并 在 mSBD1 成熟肽基因兩端加上合適的酶切位點(diǎn) EcoR I 和 Not I 及兩端的保護(hù)堿基， 設(shè)計(jì)引物 序列 （ 見(jiàn)表 1） 。 巴斯德畢赤酵母 表達(dá)外源蛋白 的方式可分為： 胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外 表達(dá) 兩種方式 [17,18]。在細(xì)胞膜上單個(gè)或群體的防御素形成孔隙或通道， 得在正常情況下在細(xì)菌體外的離子、多肽等流入到菌體內(nèi)，而菌體 內(nèi)重要的鹽類、大分子等跑到菌體外，從而使細(xì)菌的膜失去了保護(hù)作用，最終導(dǎo)致不可逆的 菌體死亡。擴(kuò)增出的 mSBD1 因與 T 載體成功連接后，將其亞克隆到畢赤酵母表達(dá)載pPIC9K 上 ， 構(gòu)建 真核表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1。它們參與了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活動(dòng) , 是內(nèi)源免疫體系成分。同時(shí)， 防御素還具有十分廣泛的抗性譜 , 可抗細(xì)菌、真菌、有囊膜病毒 ，甚至對(duì)支原體、衣原體、螺旋體及一些惡性細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞） 和艾 滋病病毒也有殺傷作用。而且用于分泌表達(dá) ， 分泌重組蛋白至培養(yǎng)基中。 終延伸 7 min。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 9 （ 6） 鑒定： 獲取的轉(zhuǎn)化子，以 5′AOX 3′AOX1 為引物 （ 見(jiàn)表 6） ，進(jìn)行菌落 PCR 篩選陽(yáng)性克隆?，F(xiàn)今對(duì)防御素的研究還只是初步階段，使 其成為新一代抗菌藥物還需進(jìn)一步深入研究。 由于防御素不同于抗生素的作用機(jī)理，所以不具有 誘導(dǎo) 細(xì)菌 耐藥性產(chǎn)生的 優(yōu)點(diǎn) ， 因此使其在食品防腐和動(dòng)物飼料添加劑等方面具有 很好的應(yīng)用前景。 表 3 引物序列 （ 2） 目的片段與表達(dá)載體的雙酶切 現(xiàn)在 分別用 EcoR I 和 Not I 對(duì) pPIC9K 載體和 目的片段 進(jìn)行 雙酶切。 （ 3） 儀器和試劑 Eppendorf 5417R 低溫高速離心機(jī)，德國(guó)生物公司生產(chǎn)； RTC100 PCR 儀，美國(guó) MJ 生物公司生產(chǎn)； DYYⅢ 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)； Tanon Gis1000 凝膠成像分析系統(tǒng)，天能科技（上海）生物公司生產(chǎn)。 選取質(zhì)粒 pPIC9K 的優(yōu)點(diǎn) 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 3 畢赤 酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，所以 需 要 表達(dá)載體與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá) 。也就是，由于防御素分子帶正電荷呈 即陽(yáng)性，能夠與呈陰性帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜表面通過(guò)靜電吸引而相互結(jié)合，合后其分子中的疏水區(qū)與菌體膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)結(jié)合，后插入到細(xì)菌的細(xì)胞膜， 其帶正電區(qū)則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電的磷脂頭2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1 的構(gòu)建 部及水分子相互作用 [1012]。 本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒PUC57mSBD1T，利用 PCR 技術(shù)，擴(kuò)增綿羊 β防御素 1 成熟肽（ mSBD1）基因。 目前 已 經(jīng) 從動(dòng)物和植物中分離純化出 200 種以上的多肽。因此， 可將防御素 作為或替代 抗生素發(fā)揮其強(qiáng)效、廣譜的抗微生物感染的作用 ， 從而為解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題提供新的方法。 圖 1： pPIC9K 質(zhì)粒圖譜 研究?jī)?nèi)容 基于本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒 PUC57mSBD1T，利用 PCR 技術(shù)，擴(kuò)增mSBD1 基因。 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察。對(duì)于 PCR 擴(kuò)增結(jié)果正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。 盡管防御素的研究工作還存在著種種困難，但隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展、新防御素基因的不斷涌現(xiàn)、防御素家族研究的不斷深入、高效表達(dá)系統(tǒng)和生物反應(yīng)器的不斷更新，我們相信防 御素必將作為新一代抗菌藥物走入我們的生 活，為人類創(chuàng)造更多的價(jià)值。巴斯德畢赤酵母由于兼具 有 原核表達(dá)系統(tǒng)的高表達(dá) 量和真核表達(dá)系統(tǒng)可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾、加工及折疊的優(yōu)點(diǎn) ,已有多種蛋白在此系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)。 pPIC