【正文】 ....... 24 各基因片段的同源重組 .................................................................................. 25 重組驗證菌落 PCR 的反應體系與反應條件 ..................................................... 25 同源重組成功的單克隆的獲取 ........................................................................ 26 Ptarget和 cas9 質(zhì)粒的去除 .............................................................................. 28 3 結果與分析 .......................................................................................................... 28 4．討論 ...................................................................................................................... 29 第五章 回補基因?qū)w生長和色氨酸生產(chǎn)的影響 .............................................................. 30 1 材料 ........................................................................................................................ 30 菌種和質(zhì)粒 ..................................................................................................... 30 2 方法 ........................................................................................................................ 30 RBS8 質(zhì)粒的擴增 ........................................................................................... 30 mutB8/mutRBS8 中 mutRBS8 質(zhì)粒的剔除 ..................................................... 31 BL2 mutB wtB holoB8 感受態(tài)的制備 ............................................. 31 RBS8 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 ........................................................................................ 31 校正曲線制作 ................................................................................................. 31 wtBL holoBL8 和 BL21 生長曲線的對比 ................................................... 31 色氨酸含量的測定 ......................................................................................... 32 3 結果分析 ................................................................................................................. 32 4 討論 ......................................................................................................................... 35 參考文獻 ........................................................................................................................... 36 致謝 .................................................................................................................................. 37 i 摘要 誘變育種是工業(yè)上獲得性能優(yōu)良的菌株的必要手段，但是在對表達載體進行生物誘變時，就會不可避免的造成工程菌本身染色體的變異，為研究這些染色體的變異對工程菌本身的影響，本實驗使用同源重組技術對通過 artp誘導突變的 BL8（ BL21表達菌敲出 3個基因后的工程菌）工程菌進行基因替換 ,并以色氨酸定位研究對象，觀察其產(chǎn)率上變化，對其突變堿基對色氨酸的產(chǎn)量的影響進行了初步研究。 同源重組是基因工程實驗中常用的技術手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用，而 red（一種能夠應用于大腸桿菌的基于 λ噬菌體 Red重組酶的同源重組系統(tǒng)）同源重組技術是利用 red系統(tǒng)是一項可在染色體水平進行遺傳操作的技術，只需要較短的同源序列而不需要特定的限制性酶切位點，即可完成。 本課題以 CRISPR為基本方法，采用同源重組技術利用 cas ptarget兩種 質(zhì)粒將突變型 BL8菌的 tnaB、 talB、 tyrA、 gabD、 gabT、 lplA、 aroF這些基因組基因片段替換到野生型 BL8菌中。得到重組后的 BL21野生菌后，首先進行了重組菌與突變菌生長曲線的對比，而后又進行了色氨酸產(chǎn)量的定量分析。最終發(fā)現(xiàn)重組菌與突變菌 B8以及 BL21的生長曲線并沒有比較明顯的差異，而最后 lplA， talB色氨酸產(chǎn)量高于野生型 B8菌低于突變型 B8菌，表明 lplA與 talB的突變堿基對色氨酸的合成有促進作用。 關鍵詞：同源重組， B8， CRISPR ii Abstract Mutagenesis is a powerful method to obtaining strains with excellent performance. However, mutagenesis will have global effect, and inevitably lead to unwanted mutations on the strain chromosome. This study aimed to investigate the relationship between chromosome mutations and strain performance. We used artp to mutate B8 strains and found some mutation loci, then artificially introduced these loci into wild type B8 strains via homologous rebination. By paring the tryptophan titers of the artp mutated strains and artificially mutated strains, we preliminarily studied the impact that the mutation loci had on the tryptophan production. Homologous rebination is momly used in geic manipulation experiment, such as gene targeting and cloning. As an important part of homologous rebination technology, redbased rebination relies on red system to do chromosome editing. It only requires short homologous arms, and no restriction site is needed. Recently, CRISPRbased homologous rebination, which consists of Cas9 protein and sgRNA, has developed into a novel rebination technique with considerable efficiency and applicability. We used this method to introduce mutated tnaB, talB, tyrA, gabD, lplA, and aroF genes of artptreated B8 strains into wild type B8 strains, then recorded the growth curve of the mutants and rebinants, and quantitatively analyzed the tryptophan production of them. Keywords： homologous rebination， B8， CRISPR北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術的研究進展 1 第一章 同源重組技術的研究進展 1 前言 微生物育種技術概述 優(yōu)良的菌株作為工業(yè)生產(chǎn)的基礎，所以獲得優(yōu)良的菌株對于生物發(fā)酵或者產(chǎn)品生產(chǎn)都是至關重要，獲得優(yōu)良的菌株主要包括選種與育種兩個過程，首先是選種，選種就是從天然的菌株中找到可以得到我們需要的生物分子或是有優(yōu)良的生物特性的菌株，然后是育種，對已有的菌株進行遺傳改良。育種主要包括自然育種與人工育種兩個方面。 （ 1） 自然育種 對自然界中的微生物，在未經(jīng)人工誘變或雜交處理的情況下進行分離和純化（見微生物的分離和純化），然后進行純培養(yǎng)和測定（見微生物測定法），擇優(yōu)選取微生物的菌種。這種方法簡單易行，但獲得優(yōu)良菌種的幾率小，一般難以滿足生產(chǎn)的需要。 （ 2） 誘變育種 以誘發(fā)基因突變?yōu)槭侄蔚奈⑸镉N技術。微生物育種技術包括物理的（如紫外線、 γ 射線、快中子等）和化學的誘變因素。化學誘變因素分為 3 種： ① 誘變劑與一個或多個核酸堿基發(fā)生化學變化，使 DNA 復制時堿基置換而引起變異，如羥胺亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等； ② 誘變劑是天然堿基的結構類似物，在復制時參入 DNA 分子中引起變異，如 5溴尿嘧啶、 5氨基尿嘧啶、 8氮鳥嘌呤和 2氨基嘌呤等； ③ 誘變劑在 DNA 分子上減少或增加 1～ 2 個堿基，使堿基突變點以下全部遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生錯誤，從而導致碼組移動突變體的出現(xiàn)，如吖啶類物質(zhì)和一些氮芥衍生物（ ICR）等。誘變育種操作簡便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產(chǎn)量，改進質(zhì)量，還可擴大產(chǎn)品品種和簡化工藝條件。如 1943 年從自然界分離到的青霉素產(chǎn)生菌的效價只有20 單位 /毫升，經(jīng)過一系列的誘變育種后，效價已達 40000 單位 /毫升； 金霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，發(fā)酵液中又積累了去甲基金霉素；谷氨酸棒桿菌 1299 經(jīng)紫外線誘變后，有的能產(chǎn)賴氨酸，有的能產(chǎn)纈氨酸，增加了產(chǎn)品的種類；土霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發(fā)酵罐的利用率。誘變育種的不足是缺乏定向性。 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術的研究進展 2 （ 2） 標號重復基因重組育種 基因重組育種就是把不同的兩個或兩個以上的生物遺傳信息一起至于一個宿主細胞中，創(chuàng)建具有目的生物特性的重組柱。具體的操作方法包括同源重組與雜交等。 同源重組技術發(fā)展 同源重組定義 傳統(tǒng)意義上的同源重組指的是，發(fā)生在非 姐妹染色單體 （ sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的 DNA 分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如 原核生物 細胞內(nèi)的 RecA、 RecBCD、 RecF、 RecO、RecR 等；以及 真核生物 細胞內(nèi)的 Rad5 Mre11Rad50 等等。同源重組反應通常根據(jù)交叉分子或 Holliday結構（ Holliday J