【正文】 重復 3 次； III 用 120 181。將活化后的細胞涂布至 amp 抗性的 LB 平板上過夜培養(yǎng)。 CB3 中（吸附柱放入收集管中）， 120xxrpm（ ~13， 400Xg）離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 （ 9）將離心吸附柱 Spin Column PA 置于一個新的 管中，加入去離子水30ul，室溫放置 2min， 120xxrpm離心 1min。 37℃ 過夜培養(yǎng)。目的 DNA 長度 ≤500bp時，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入 DNA 純化柱中，離心。 根據(jù) wtBL21 上的突變位點，利用 serial cloner 分析軟件設計合成下列引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_apc PF_gabD(2)_spc PF_gabD_spc PF_gabT_spc PF_lplA_spc PF_talB_spc PF_tnaB_spc PF_tyrA_spc TCCTAGGTATAATActagtCCCGGCGATAATATCTGAAAgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtTGTGGTTTGCGGCGGTAAAGgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCAACTGGTTCAATTTGTTGAgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCGGACGCAAAACTCACCGCCgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCAAGTCTGGCGTTTTGTCCGgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtGCCAGCTCTTTCAGCAGTGTgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCGAACTTATCCACAATACGCgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtGCCATGCTGGCGGCGCACGAgttttagagctagaaatagc 59 59 59 59 59 59 59 59 儀器 C1000 PCR 儀 2 方法 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 10 PCR反應體系與反應條件 Ptarget 質(zhì)粒的 PCR Q5 反應體系 100ul 體系 5*Q5 reaction buffer 20ul 10mM dNTP 2ul 10uM Fprimer 5ul 10uM Rprimer 5ul DNA Template 1pg~1ng Q5 DNA polymerase 1ul 5*High GC enhancor 20ul ddH2O 47ul 反應條件 98℃ 預變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 47℃ 退火溫度 30s 72℃ 延伸 30s 4 個循環(huán)后 98℃ 變性 10s 62℃ 退火 30s 72℃ 延伸 50s 30 個循環(huán)后 72℃ 補充延伸 5min 4℃ 保存 for ever 將 PCR 產(chǎn)物中加入 5ul 5 X solution buffer 后，調(diào)節(jié)電壓 150V，電流 130A，點擊 star，開始電泳。 （ 1） 適應 當噬菌體 DNA 侵入菌體時， CRISPR 系統(tǒng)就會知道合成 cas 蛋白， cas 蛋白將對其 DNA 進行切割，使其形成無數(shù)個 30bp 左右的 DNA 片段?？茖W工作者便開始對其的研究，并將其正式命名為 CRISPR。后來，第二代人工核酸酶 ——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶，它的出現(xiàn)在北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 5 一定程度上替代了 ZFN。應用此方法有一個缺點就是會在基因上留下 34 或 36bp 的特殊序列。這樣，靶基因兩翼序列已知的條件下就可以通過 Red 重組技術(shù)對該基因進行跳出、敲入、點突變等操作，還可在靶基因的上下有加入適當?shù)膯幼雍椭兄蛔中蛄幸粭l街基因的表達。生化實驗表明： RecBCD 蛋白質(zhì)使一段單鏈 DNA 和所在染色體分北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 3 開，在 RecA 蛋白質(zhì)的幫助在，這根自由的鏈和另一個染色體的一根鏈上的互補序列形成一個新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。并在基因檢測，重組基因表達方面有廣泛的應用。如 1943 年從自然界分離到的青霉素產(chǎn)生菌的效價只有20 單位 /毫升，經(jīng)過一系列的誘變育種后，效價已達 40000 單位 /毫升； 金霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，發(fā)酵液中又積累了去甲基金霉素；谷氨酸棒桿菌 1299 經(jīng)紫外線誘變后，有的能產(chǎn)賴氨酸，有的能產(chǎn)纈氨酸，增加了產(chǎn)品的種類；土霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發(fā)酵罐的利用率。 關(guān)鍵詞：同源重組， B8， CRISPR ii Abstract Mutagenesis is a powerful method to obtaining strains with excellent performance. However, mutagenesis will have global effect, and inevitably lead to unwanted mutations on the strain chromosome. This study aimed to investigate the relationship between chromosome mutations and strain performance. We used artp to mutate B8 strains and found some mutation loci, then artificially introduced these loci into wild type B8 strains via homologous rebination. By paring the tryptophan titers of the artp mutated strains and artificially mutated strains, we preliminarily studied the impact that the mutation loci had on the tryptophan production. Homologous rebination is momly used in geic manipulation experiment, such as gene targeting and cloning. As an important part of homologous rebination technology, redbased rebination relies on red system to do chromosome editing. It only requires short homologous arms, and no restriction site is needed. Recently, CRISPRbased homologous rebination, which consists of Cas9 protein and sgRNA, has developed into a novel rebination technique with considerable efficiency and applicability. We used this method to introduce mutated tnaB, talB, tyrA, gabD, lplA, and aroF genes of artptreated B8 strains into wild type B8 strains, then recorded the growth curve of the mutants and rebinants, and quantitatively analyzed the tryptophan production of them. Keywords： homologous rebination， B8， CRISPR北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 1 第一章 同源重組技術(shù)的研究進展 1 前言 微生物育種技術(shù)概述 優(yōu)良的菌株作為工業(yè)生產(chǎn)的基礎，所以獲得優(yōu)良的菌株對于生物發(fā)酵或者產(chǎn)品生產(chǎn)都是至關(guān)重要，獲得優(yōu)良的菌株主要包括選種與育種兩個過程，首先是選種，選種就是從天然的菌株中找到可以得到我們需要的生物分子或是有優(yōu)良的生物特性的菌株，然后是育種，對已有的菌株進行遺傳改良。 本課題以 CRISPR為基本方法，采用同源重組技術(shù)利用 cas ptarget兩種 質(zhì)粒將突變型 BL8菌的 tnaB、 talB、 tyrA、 gabD、 gabT、 lplA、 aroF這些基因組基因片段替換到野生型 BL8菌中。微生物育種技術(shù)包括物理的（如紫外線、 γ 射線、快中子等）和化學的誘變因素。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如 原核生物 細胞內(nèi)的 RecA、 RecBCD、 RecF、 RecO、RecR 等；以及 真核生物 細胞內(nèi)的 Rad5 Mre11Rad50 等等。RecBCD 蛋白的功能是從 DNA 雙鏈的一段進入往 DNA 的另一端運動，在運動過程中他會將 DNA 的雙鏈分開，并與此同時將分開的兩個 DNA 單鏈絞在一起。 Red 同源重組技術(shù)的原理是將一段攜帶與靶基因兩翼各有 40~60bp 同源序列的 PCR 片段導入宿主菌細胞，利用 K 噬菌體 Red 重組酶的作用是導入細胞的線性 DNA 片段與染色體的特定扒啊序列進行同源重組，靶基因被標記基因置換下來。 一般通過以下四種方法完成標記基因的剔除： （ 1）如果線性 DNA 中含有 ori 基因那么，可以一步篩選法將中間為篩選基因兩端為同源序列的標記基因重組下來。 ［ 3］ 鋅指核酸內(nèi)切酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是人類所創(chuàng)造的第一代核酸內(nèi)切酶，鋅指是指的一類能夠結(jié)合 DNA 的蛋白質(zhì)，人類細胞轉(zhuǎn)錄因子中幾乎有一半含有鋅指結(jié)構(gòu)， ZFN 是將鋅指蛋白和核酸內(nèi)切酶 Fok1 融合形成的核酸內(nèi)切酶，利用他能夠在各種復雜基因組的特定位置創(chuàng)造 DNA 的雙鏈切口的這一特性。 20xx 年， CRISPR/cas9 出現(xiàn)，它主要根據(jù)大腸桿菌的自主免疫，然后將已有的基因進行改造而成。 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 6 CRISPR的原理 圖 11 CRISPR 工作原理 CRISPR/cas9 基因編輯技術(shù)是 ZFN 和 TALEN 之后迅速發(fā)展起來的第三代基因編輯技術(shù)，該技術(shù)是細菌以及古生菌中存在的 Ⅱ 型 CRISPR/Cas 基因進行改造而形成的。 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 7 每段的邊距保持一致 （ 3） 干擾： crRNAs 干擾入侵核酸 crRNP 將會通過 crRNA 迅速尋找與其互補的 DNA 片段，并進行特異性結(jié)合，然后在復合體的作用下將其降解，從而達到保護宿主菌的作用。放入 5560℃ 水浴中，間斷搖晃混合，直至凝膠完全融化（約 510min），放置使其冷卻至室溫。 gibson 反應體系 Gibson assembly ddH2O 基因片段 5ng 反應條件 50℃ 4℃ 15min forever 將質(zhì)粒 Ptarget導入 DH5α中 （ 1） 加入 5ul質(zhì)粒加入 BH5a 細胞 （ 2） 在冰盒上放置 30min 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 12 （ 3） 放在水浴鍋上 42℃ ， 45s （ 4） 冰盒放置 2min （ 5） 加入 LB 在 37℃ ， 200rp