【正文】 致謝 本論文是在導(dǎo)師郭寶太教授的悉心指導(dǎo)下完成的，從課題的選題、方案的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)的具體操作到論文的完成都傾注了導(dǎo)師的心血。脫毒種薯生產(chǎn)應(yīng)用中，主要采用進(jìn)口抗血清或試劑盒對(duì)馬鈴薯病毒進(jìn)行檢測(cè)。 4）安全性高?？捡R斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合物 520min 內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，顏色最穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。 進(jìn)行金屬親和層析時(shí)， 離子類型、咪唑濃度以及 PH 等因素都會(huì)影響蛋白與離子的親和力 ， 其中，咪唑濃度尤其重要。 Nie[10]利用一步 RTLAMP 和兩步 RTLAMP 技術(shù)檢測(cè)了 240 份樣品中的馬鈴薯病毒，檢出率均達(dá)到 %。包被的抗原是病毒陽性物，加入抗血清后反應(yīng)孔顯色，且隨著抗血清稀釋度的增加顏色變淺。洗脫收集的純化蛋白進(jìn)行電泳， 獲得了 36KDa 的高純度重組蛋白帶（圖 1，泳道 3） M 1 2 3 圖 1 PVMCP 基因的表達(dá)和重組蛋白的純化 M： Protein marker 1: 菌體總蛋白 （沒誘導(dǎo)） 2: 誘導(dǎo)后的蛋白 3: 純化出的重組蛋白 蛋白的透析、濃縮與定量 200mL 菌液總蛋白提取后經(jīng)過結(jié)合緩沖液溶解、純化后得到 5mL 洗脫液，重組蛋白經(jīng)透析濃縮，用 Brandford 法進(jìn)行了定量。 6）洗板：同 2）。 2）抗血清： 用 PBST 按 1:1000 稀釋，后等比稀釋。 4） 595nm 下測(cè)吸光值 。 7） 10 mL 洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集中間的 5 mL 洗脫液。 8) 沉淀進(jìn)行包涵體溶解：棄掉上清液，每管沉淀中加入 750μ L 結(jié)合緩沖液，吹打重懸沉淀，再加入 750μ L 結(jié)合緩沖液，震蕩均勻，約 1min 后 4℃， 12020rpm，離心 10min；收集上清液，重復(fù)上述步驟，加入 750μ L 結(jié)合緩沖液吹打重懸，12020rpm， 4℃離心 15min，收集上清液。 7） SDSPAGE 檢測(cè)誘導(dǎo)效果。 TMB 使用液： TMB（ 1mg/mL 溶于 DMSO） 1mL 底物緩沖液 9mL 30%H2O2 1μL 8 方法 PVMCP 基因原核表達(dá)的誘導(dǎo)與鑒定 1）用 接種環(huán)以無菌操作挑取重組菌 BL21(pET22bPVM)菌液一環(huán)，劃線接種于含有 100181。 超凈工作臺(tái)（安泰公司） 振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅） 電子天平（ Satorius） pH 儀（ DENVER） 觀片燈（山東 兗州通用醫(yī)療器械有限公司 ） 恒溫循環(huán)儀（北京六一） 聚丙烯酰胺凝膠制備系統(tǒng)（ BioRad） 微型垂直板電泳裝置（ Miniprotean,BioRad） 水平脫色搖床（北京六一） 培養(yǎng)基 LB 固體和液體培養(yǎng)基， 調(diào) pH 至 ,高壓蒸汽滅菌 121℃ 下 15min。 本研究目的是利用重組 CP 制備出 PVM 高效價(jià)的抗血清，為實(shí)現(xiàn)基于重組CP 多克隆抗體的 DASELISA 檢測(cè)技術(shù)的建立奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為 PVM 抗血清及 ELISA 檢測(cè)試劑盒的國產(chǎn)化與大量生產(chǎn)提 供技術(shù)保障。還有一些病毒純 化 困難，不易得到純化的病毒粒 子 。檢測(cè)中可用肉眼或比色法判斷測(cè)定結(jié)果。對(duì)脫毒材料進(jìn)行嚴(yán)格地檢測(cè)與篩選，才能獲得真正的脫毒材料，進(jìn)一步保障生產(chǎn)上脫毒種薯的增產(chǎn)效果。馬鈴薯病毒病的種類繁多， 在我國 已 發(fā)現(xiàn) [10 種以上 的病毒，其中 常見的馬鈴薯病毒主要 就 有六種 [3]。 馬鈴薯在我國的種植范圍較廣， 但對(duì)于單位面積的產(chǎn)量而言， 卻與馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)達(dá)的國家有一定的差距 。 制備的抗血清與 PVM 陽性物呈陽性反應(yīng)，也就是說本研究制備的抗血清具有檢測(cè) PVM 的能力。 本研究利用重組 CP 制備出 了 PVM 高 滴度 的抗血清，為進(jìn)行 PVM 的 ELISA 檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為 PVM 的ELISA 試劑盒的組裝與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 導(dǎo)致這種局面的重要原因之一就是病毒積累引起的種薯退化，這在很大程度上限制了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 [1]。 馬鈴薯 M病毒 ( Potato virus M, PVM )是香石竹潛隱病毒屬（ Carlavirus）成員，它的基因組為正單鏈 RNA病毒 [4]。 植物病毒檢測(cè)方法可以歸納為三大類：生物實(shí)驗(yàn)法，基于核酸的分子檢測(cè)方法及免疫學(xué)（血清學(xué)）方法 [6]。 ELISA 用于檢測(cè)馬鈴薯病毒始于 Caspe對(duì)馬鈴薯卷葉病毒 (PLRV)的檢測(cè)，認(rèn)為用 ELISA 技術(shù)進(jìn)行 PLRV 的常規(guī)鑒定是可行的 [7]。 由于病毒粒子制備的困難，導(dǎo)致國產(chǎn)馬鈴薯病毒抗血清非常缺乏，明顯影響了其應(yīng)用。 本研究的具體的研究內(nèi)容是： 1）誘導(dǎo)重組菌 BL21(pET22bMCP)中 PVMCP基因的表達(dá)。 氨芐抗性的篩選平板 主要試劑配方 12%分離膠： 蒸餾水 30% arcBis mL Tris(pH ) mL 10%SDS 180μL 10% Aps 180μL 6 TEMED 7μL 5%濃縮膠： 蒸餾水 30% arcBis 650μL Tris(pH ) 500μL 10%SDS 40μL 10% Aps 40μL TEMED 4μL 脫色液配制： 蒸餾 水 500ml 95%乙醇 400mL 冰醋酸 100ml PBS 配制： KH2PO4 Na2HPO4 NaCl 8g KCl 加去離子水 800mL，攪拌溶解，加入濃鹽酸調(diào) pH 至 ，最后定容到 1L。g/mL Amp 的 LB 固體培養(yǎng)液， 37℃ 培養(yǎng) 24h。 菌體總蛋白的提取和包涵體的溶解 1）將上述步驟中剩余的 197ml 在 4℃下、 4000rpm 離心 15min。 9） 用濾膜將上清液過濾。 8） 40 mL ddH2O 洗柱。 5）利用記錄讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中的蛋白濃度。 3）二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（ H+L） 1:8000 稀釋，用 PBST 稀釋。 7）加二抗： 100μL每孔， 37℃ 孵育 45min。 測(cè)定體系如表 1 所示， 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2 所示，并通過 OD595 值計(jì)算出純化蛋白的濃度： 30ul 待測(cè)液（ OD595為 ），計(jì)算出其濃度為 ； 60ul 待測(cè)液（ OD595 為 ），計(jì)算出其濃度為 。包被健康試 管苗研磨液作抗原（陰性對(duì)照）與不加抗原（空白對(duì)照）的反應(yīng)孔不顯色。 血清學(xué)的 一個(gè) 典型方法 就是酶聯(lián)免疫法 ，該 方 法適合于大規(guī)模的 測(cè)試 11]。若 洗滌 液中的咪唑濃度太低，洗脫物中的雜蛋白將不能被完全洗脫，從而使目的蛋白純度過低，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn) 。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中，一定要?jiǎng)幼餮杆?，快速完成?shí)驗(yàn)。全過程不涉及病毒粒子， 沒有造成病毒擴(kuò)散的隱患。 應(yīng)用馬鈴薯病毒進(jìn)口檢測(cè)產(chǎn)品，不僅價(jià)格高，限制了應(yīng)用。導(dǎo)師淵博 的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度以及對(duì)于科學(xué)不斷追求的精神讓我受益匪淺，并給我很大啟迪。 重組 CP 途徑不僅具有穩(wěn)定可靠性，同時(shí)也具有技術(shù)難度低、成本也低的特點(diǎn)，通過該途徑制備出足量抗血清是切實(shí)可行的。 15 馬鈴薯病毒抗血清的生產(chǎn)與應(yīng)用 在我國，馬鈴薯病毒抗血清的制備工作時(shí)斷時(shí)續(xù)， 制備出的抗血清都滿足不