【正文】 了科研的需要。 一周之內(nèi)就可制備出 23 只兔子需要的免疫劑量 3）方法穩(wěn)定可靠。本實驗采用考馬斯亮藍法對重組蛋白質進行定量測定。 對原核生物來講，一般采用 Ni 離子親和層析法對其重組蛋白進行純化 [13]。 LAMP 是檢測病毒的新型分子生物學技術，在馬鈴薯病毒檢測中也得到了有效利用。 陰性 空白 1K 2K 4K 8K 16K 32K 64K 128K 256K 512K 圖 3 抗血清效價的測定 13 表 2 抗血清效價的測定值 抗血清濃度 陰性 空白 1K 2K 4K 8K 16K 32K 64K 128K 256K 512K 一組 二組 PVM 的 ELISA 測定 PVM 間接 ELISA 檢測的初步結果見圖 4。 利用咪唑濃度為 30mM 的結合緩沖液對重組菌 BL21（ pET22bPVM）誘導表達的包涵體蛋白進行純化。 5）加一抗： 100μL每孔， 37℃ ， 1h。 抗血清的效價測定 制備好的抗血清通過 間接 ELISA 測定其效價，樣品的稀釋和步驟如下： 樣品稀釋： 1）抗原： PVM 蛋白定量為 2mg/ml，設定每孔包被抗原的量為 ，每孔抗原包被 100μL，所以抗原用 PBS 以 1:1000 稀釋，濃度為 2μg/mL。 3）向各個試管中加入 2850uL 考馬斯亮藍 G250 染液，充分搖勻。 6） 20 mL 結合緩沖溶液洗柱將未能結合上柱的蛋白洗掉。 7)將裂解液分裝在 離心管中，用微量離心機于 4℃、 12020rpm 離心2min。 6）接出 2mL 誘導的菌液分別裝入 2 個 離心管中作為誘導樣。 底物緩沖液（ pH ）： 檸檬酸 Na2HPO4 溶于去離子水中，調(diào) pH ，定容至 100mL。其 它 試劑均為分析純試劑。國內(nèi)未見 PVMCP基因原核表達的研究。 有 些病毒在 宿 主 的 含量 少 ，難以獲得足夠的 純化后的 抗原。獲得純化的特異性抗體及酶標記抗體是有效開展 ELISA檢測的關鍵。病毒脫除難度與效果，因病毒種類不同而異， PVM的脫除就比較困難。馬鈴薯病毒嚴重制約了馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)化，當發(fā)生復合侵染時，產(chǎn)量損失更高。馬鈴薯是非常重要的糧、菜兼用作物。利用高純度重組 CP 免疫 家 兔制備出了抗血清，間接 ELISA 法測定顯示抗血清的效價為 1： 64K。 關鍵詞 ： 馬鈴薯 M 病毒； CP 基因；原核表達； 重組 CP；抗血清制備 2 Preparation of antiserum against rebinant coat protein of potato virus M Student majoring in biotechnology Liu Yang Tutor Guo Baotai Abstract: The rebinant bacterium strain BL21(pET22bPVM) was induced by IPTG, a 36KD specific protein band was found in the SDSPAGE pattern of total protein, its size was the same as expected, the result showed that the prokaryotic expression of CP gene of potato virus M (PVM) was successful. Total cellular protein of the rebinant bacterium was extracted by lysozyme method and then the PVM rebinant CP was purified with nickel iron affinity chromatography column. Antiserum was prepared by injection of rabbits with the highpurity rebinant CP. Indirect ELISA detection indicated that the titer of the antiserum was 1:64K. Positive reaction was observed between the prepared antiserum and PVM positive sample in IDELISA. The antiserum prepared in this research has the ability to detect the PVM. In this research, high titer antiserum of PVM was prepared by the use of rebinant CP, it has laid the foundation for the ELISA detection of PVM, and also laid the foundation for the assembly and application of ELISA detection kit for PVM. Key words: potato virus M。 馬鈴薯 滿足人們對經(jīng)濟作物的各種要求 ，同時它 可以加工成各種 工業(yè) 產(chǎn) 品，使用及其廣泛 。基因組序列中有 6個 ORFs，另外 5’端有長度為75個核苷酸非編碼區(qū)， 3’端有 70個核苷酸的 poly(A)[5]。 馬鈴薯病毒檢測的方法很多，但用于馬鈴薯種苗病毒檢測的方法要求迅速、廉價 、無誤 。免疫學方法的靈敏度高、特異性強、技術步驟比較簡單、 能夠對 大量田間樣品 進行 檢測。 利用 分子生物學技術 可以解決經(jīng)典方法中遇到的 抗原（馬鈴薯病毒粒子）制備困難 問題。 2）提取并溶解包涵體、利用鎳離子親和層析法純化出重組 CP，并進行透析、濃縮與定量。高溫高壓滅菌后室溫保存。 2）挑取重組菌 BL21(pET22bPVM)的單菌落接種在 10ml 含有 100181。 2）棄去離心上清液，對沉淀進行稱重，加入裂解緩沖液（每克大腸桿菌加入 3ml），將菌體重懸。 9 PVM 重組 CP 的純化 使用 5mL 鎳柱純化目的蛋白 PVMCP，純化體系如下： 1）用 20 mL ddH2O 洗柱，避免柱子中存有酒精。 9） 20 mL 20%乙醇洗柱，封柱， 4℃保存柱子。 PVM 重組 CP 抗血清的制備 抗血清制備 將蛋白樣品的濃度調(diào)整到 1mg/mL，共需要約 46mL，送上海生工制備抗血 10 清。 4）免疫前血清：用 PBS 按 1:1000 稀釋。 8) 洗板： PBST 洗滌 4 次，每次 3min。結果顯示 200mL 菌液可純化出 6mg 重組 CP。結果表明本實驗制備的重組 CP 抗血清與 PVM 呈陽性反應，也就是說該抗血清具有檢測PVM 的能力，是 PVM 特異性抗血清。在生產(chǎn)上檢測馬鈴薯病的 ELISA 具體方法主要有三種 [11]。 若咪唑濃度較高，將會洗脫掉部分目的蛋白，導致目的蛋白得率下降。 重組 CP 途徑與 本研究的創(chuàng)新點 本研究采用了 重組 CP 途徑制備馬鈴薯 M 病毒 的 抗血清 。 5）制備的抗血清效價高。在實際檢測中會發(fā)現(xiàn)必須不能及時獲得相關產(chǎn)品也是一種限制。在論文試驗階段以及論文寫作階段，導師給我提出了嚴格的要求，引導我不斷開闊思路，鼓勵我大膽