【正文】 創(chuàng)新。 本研究 工 作是總體研究的一部分，本實(shí)驗(yàn)室的目標(biāo)是利用重組 CP 制備出 6 種 主要病毒的特異性抗血清。目前， 未見 重組 CP 抗血清用于 PVM 檢測的報(bào)道。 2） 可大量 快 速制備出重組 CP。 一般 采用紫外吸收法 [14]和考馬斯亮藍(lán)染色法 [15]對 重組 蛋白 進(jìn)行定量。 對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后，要先對細(xì)菌總蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 分析，之后再對目的蛋白進(jìn)行純化。 基于 病毒核酸的分子生物學(xué)檢測法是檢測植物病毒的有效方法 [9]。抗血清效價(jià)≥3陰性值，結(jié) 果表明制備的抗血清的效價(jià)為 1： 64k（表 2）。重組蛋白的預(yù)期值為 36KDa，電泳結(jié)果顯示重組蛋白的分子量與預(yù)期大小一致，也就是 PVMCP 基因在受體菌中得到了順利表達(dá)。 4）洗板：同 2）。四免后采血，耳靜脈采血 1ml， ELISA 檢測抗血清效價(jià)。 2)分別將 30uL,60uL 待測蛋白質(zhì)樣品加入到另外兩支試管中，并用 PBS 補(bǔ)足至 150?l。 5）過濾過的樣品溶液 510mL。 6)室溫下放置 30min 左右，至裂解液不再粘稠。 5）向剩余培養(yǎng)液中加入 1%培養(yǎng)液體 積的 100mM IPTG(終濃度 1mM)誘導(dǎo)表達(dá)，37℃ 震蕩培養(yǎng) 4h 左右。 PBST 洗滌緩沖液： PBS 緩沖液 100mL Tween20 50μL 封閉液： BSA 加 PBST 緩沖液至 5mL。 主要試劑 與儀器 三氯乙酸、 SDS、 Glycine、 Urea、 Acrylamide、 Bisarcylamide、二抗（上海生工）；咪唑（北京鼎國）；去氧膽酸鈉（上海伯奧）；蛋白酶抑制劑 (PMSF)(Sigma)；蛋白質(zhì) Marker；溶菌酶（北京索萊寶）； 蛋白純化柱 (HiTrap Chelating HP)(HE Heacthcare)。 Cerovska[8]等克隆了 PVM的 CP基因并制備了重組 CP的抗血清 ，且成功用于Wsetern分析。但是 用這種方法 制備抗血清存在很多弊端。 ELISA檢測法仍然是國際馬鈴薯中心認(rèn)可的馬鈴薯病毒檢測的最基本方法。通過莖尖剝離與培養(yǎng)擴(kuò)繁，可以獲得大量無毒（脫毒）試管苗，并可 進(jìn)一步獲得脫毒微型薯與種子。 馬鈴薯病毒能夠?qū)е埋R鈴薯品種退化，具體表現(xiàn)是既影響馬鈴薯的產(chǎn)量，也會(huì)造成質(zhì)量的嚴(yán)重下降 [2]。 preparation of antiserum 3 引言 馬鈴薯 (Solanum tuberosum L.)是茄科茄屬的一年生草本植物，食用部分為塊莖。 用溶菌酶 方 法 首先 提取 細(xì) 菌總蛋白，然后利用鎳離子親和層析 純化重 組蛋白，獲得了高純度的 PVM 重組 CP。 coat protein (CP) gene。遺傳上馬鈴薯是同源四倍體的作物，雖然可以有性繁殖，但 一般利用塊莖進(jìn)行無性繁殖。其中外殼蛋白（ CP）是由第三個(gè)編碼序列中的一個(gè) ORF編碼的，其大小約為 34kDa[5]。 基于核酸的分子檢測方法是在 PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上建立起來的檢測技術(shù)， PCR方法特異性好，靈敏度高 。 ELISA仍然是 當(dāng) 前生產(chǎn)應(yīng)用最 方便 、最廣泛的檢測 技術(shù)。 具體方法就是利用原核表達(dá)的重組 CP作抗原制備出馬鈴薯病毒抗血清。 3）利用高純度重組 CP 免疫家兔制備出高效價(jià)抗血清。 考馬斯亮藍(lán) G250（ 5）染液配制： 考馬斯亮 藍(lán) G250 20mg 95%乙醇 10mL 濃磷酸 20mL 定容至 40mL， 4℃ 保存。g/mL Amp的 LB 液體培養(yǎng)液， 37℃ 震蕩培養(yǎng)過夜。 3)每克大腸桿菌中加入 8μ LPMSF（ 50mM）和 80μ L 溶菌酶（ 10mg/mL）。 2）用 mL 的 硫酸鎳洗柱掛鎳，活化純化柱。 純化蛋白的 SDSPAGE 檢測 PVMCP基因誘導(dǎo)表達(dá)的效果及重組 CP純化效果都通過 SDSPAGE檢測、確認(rèn)。初免劑量為 ，二免、三免、四免劑量為 。 具體步驟： 1）包被抗原：將抗原按 每孔包板，陰性對照用免疫前血清 100μL 每孔，空白對照用碳酸鹽緩沖液 100μL每孔包板， 37℃ ， 2h。 9）測 OD 值： 450nm 波長。 目的蛋白 12 表 1 Bradford 蛋白定量法測定體系 試管號 0 1 2 3 4 5 6 7 標(biāo)準(zhǔn) BSA 溶液（ ul） 0 20 40 60 80 100 待測蛋白溶液 (ul) 30 60 PBS（ μl) 150 130 110 90 70 50 120 90 考馬斯亮藍(lán)（ ml) 圖 2 蛋白質(zhì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 抗血清 :效價(jià) 的測定 PVM 陽性物購自 Agdia 公司，間接 ELISA 反應(yīng)中有顏色，呈陽性反應(yīng)，陰性對照無顏色，該結(jié)果表明本研究制備的抗血清具有 檢測 PVM 的能力，是 PVM特異性抗血清。 目測結(jié)果表明抗血清稀釋度為 1:8000 時(shí)，反應(yīng)孔有可見的顏色，呈陽性。 DASELISA 于 1977年建立，白艷菊等利用該法對馬鈴薯病毒進(jìn)行檢測時(shí)對其做出了改進(jìn) [12]。 另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洗脫液中的咪唑濃度也要合適，洗滌與洗脫液合理搭配才能有好的純化效果。 與病毒粒子作抗原的傳統(tǒng)途徑相比， 重組 CP 途徑的優(yōu)點(diǎn)在于： 1） 制備 的重組 CP（抗原）純度高。 6）花費(fèi)低。另外，檢測實(shí)際也有保質(zhì)期，檢測試劑或試劑盒存放時(shí)間長了，其質(zhì)量也會(huì)受影響，抗血清的效價(jià)會(huì)變低。在論文完成之際，謹(jǐn)向我的導(dǎo)師致以最誠摯的感謝！ 在實(shí)驗(yàn)和論文的完成過程中師姐辛佳、師兄宋志成給予了我專業(yè)知識以及實(shí)驗(yàn)方面的幫助，師姐師兄的認(rèn)真負(fù)責(zé)將成為我日后學(xué)習(xí)工作的榜樣，在此特別感謝！ 值此論文完成之際，謹(jǐn)向所有幫助、支持過我的老師與同學(xué)致以最誠摯的謝意！ 參考文獻(xiàn)： [1] Jansky S， Jin L， Xie K， Xie C， Spooner D. Potato production and breeding in China. Potato Research， 2020, 52 (1)： 57–65. [2]SolomonBlackburn R M, Barker H. Breeding virus resistant potatoes（ Solanum tuberosum）：A review of traditional and molecular approaches. Heredity, 2020, 86 (1)： 17–35. [3] Gilbert J, Spillane C, Kavanagh T A, et al. Elicitation of Rxmediated resistance to PVX in potato does not require new RNA synthesis and may involve a latent hypersensitive response. 16 Mol Plant Microbe Interact, 1998, 11 (8)： 833–835. [4] Zavriev S K. The genome anization of potato virus M RNA[J]. Journal of General Virology, 1991, 72: 914. [5] Robert R M, Paul K, Keese M J, et a1． Evolution and molecular biology of Luteovirus [J]． Annu． Rev． Phytopathol, 1990, 28： 341363. [6] Makko