馬鈴薯m病毒重組cp抗血清的制備畢業(yè)論文(文件)
【正文】 l K, Keese M J, et a1． Evolution and molecular biology of Luteovirus [J]． Annu． Rev． Phytopathol, 1990, 28： 341363. [6] Makkouk K, Kumari S. Molecular diagnosis of plant viruses [J]. Plant Disease, 2020, 24(2):135138. [7] Casper R. Detection of potato leafroll virus on potato and in Physalis floridana by enzymelinked innunosorbent assay (ELISA) [J]. Phytopathol. Z, 1977, 96: 97107. [8] Cerovska N, Moravec T, Plchova H,et al. Production of polyclonal antibodies to the rebinant Potato virus M (PVM) nonstructural triple gene block protein 1 and coat protein[J]. Journal of phytopathology 2020, 160:252254. [9] 魏廣彪．馬鈴薯卷葉病毒的分子鑒定與檢測(cè)技術(shù) [D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 2020， 5． [10] Nie X Z. Reverse transcription loopmediated isothermal amplification of DNA for detection of potato virus Y[J]. Plant Disease, 2020, (89):605610. [11] 呂典秋，李學(xué)湛，呂文河，等． NCMELISA 檢測(cè)馬鈴薯 Y 病毒 (PVY)技術(shù)的研究及應(yīng)用 [J]．中國(guó)馬鈴薯， 2020， 20(6)： 339304． [12] 白艷菊，范國(guó)權(quán)，高燕玲，等． 馬鈴薯 M 病毒提純技術(shù)及抗血清制備．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020,37（ 5）： 479480． [13] 邱德義，楊雷亮，岳巧云．李痘病毒 CP 基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其抗血清制備．植物檢疫， 2020， (5):271～ 274． [14] 鄧叢良，韓麗娟，燕照玲 ， 等．百草花葉病毒 CP 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及抗血清的制備 .植物病理學(xué)報(bào)， 2020, 35（ 5）： 442～ 445． [15] 孫現(xiàn)超，安德榮，薛楊．大麥條紋花葉病毒中國(guó)株 CP 基因克隆分析、原核表達(dá)及抗血清制備．植物病理學(xué)報(bào)， 36（ 5）： 397～ 403． 。導(dǎo)師淵博 的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度以及對(duì)于科學(xué)不斷追求的精神讓我受益匪淺，并給我很大啟迪。 本研究利用重組 CP 成功 制備出了 高效價(jià)的抗血清，為實(shí)現(xiàn)基于重組 CP 多克隆抗體的 DASELISA 檢測(cè)技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為 PVM 的 ELISA檢測(cè) 及 ELISA 檢測(cè)試劑盒的國(guó)產(chǎn)化與大量生產(chǎn)提供了技術(shù)保障。 應(yīng)用馬鈴薯病毒進(jìn)口檢測(cè)產(chǎn)品，不僅價(jià)格高，限制了應(yīng)用。創(chuàng)新點(diǎn)在于利用重組 CP 制備出了高效價(jià)抗血清，且制備的抗血清可以用于馬鈴薯 M 病毒的 ELISA 檢測(cè)。全過(guò)程不涉及病毒粒子， 沒(méi)有造成病毒擴(kuò)散的隱患。得到高純度病毒粒子則非常困難 ，花費(fèi)大耗時(shí)長(zhǎng) 。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一定要?jiǎng)幼餮杆?，快速完成?shí)驗(yàn)。 對(duì)抗血清制備研究來(lái)說(shuō)，抗原的定量時(shí)基本而重要的的要求。若 洗滌 液中的咪唑濃度太低，洗脫物中的雜蛋白將不能被完全洗脫，從而使目的蛋白純度過(guò)低，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn) 。 目的蛋白的純化與定量 獲得高純度重組 CP 是本研究的關(guān)鍵。 血清學(xué)的 一個(gè) 典型方法 就是酶聯(lián)免疫法 ，該 方 法適合于大規(guī)模的 測(cè)試 11]。 陰性 空白 500 1K 2K 4K 8K 16K 32K 圖 4 PVM測(cè)定中的顯色結(jié)果 3 討論 馬鈴薯病毒的檢測(cè)方法 用于馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法很多， 與其他植物病毒一樣， 最主要的 檢測(cè) 方法仍然是分子生物學(xué)方法與血清學(xué)（免疫學(xué)）方法。包被健康試 管苗研磨液作抗原（陰性對(duì)照）與不加抗原（空白對(duì)照）的反應(yīng)孔不顯色。圖 3 是顯色 20min， 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。 測(cè)定體系如表 1 所示， 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2 所示，并通過(guò) OD595 值計(jì)算出純化蛋白的濃度： 30ul 待測(cè)液（ OD595為 ），計(jì)算出其濃度為 ； 60ul 待測(cè)液（ OD595 為 ），計(jì)算出其濃度為 。 2 結(jié)果與分析 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 重組菌 BL21（ pET22bPVM）菌液用 1mM IPTG 在 37℃ 誘導(dǎo) 4 小時(shí)，在SDSPAGE 圖譜上有一條大小約為 36KDa 的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白帶，且表達(dá)量很大（圖 11 1，泳道 2）。 7）加二抗： 100μL每孔， 37℃ 孵育 45min。 3）封閉：封閉液 100μL每孔， 37℃ ， 1h。 3）二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（ H+L） 1:8000 稀釋，用 PBST 稀釋。 三免，第 7 周，免疫用抗原同二免。 5）利用記錄讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中的蛋白濃度。定量方法如下： 1）取 6 支試管并將其編號(hào)，然后分別將 0， 20， 40， 60， 80， 100?l 1mg/mL牛血清白蛋白（ BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液 （ 1mg/ml）按梯度對(duì)號(hào)加入試管中，并加入 PBS補(bǔ)足到 150?l。 8） 40 mL ddH2O 洗柱。 4） 20mL 結(jié)合緩沖溶液平衡柱子。 9） 用濾膜將上清液過(guò)濾。 5)等待裂解液變稠，每克大腸桿菌中加入 20μ LDNaseⅠ (1mg/mL)。 菌體總蛋白的提取和包涵體的溶解 1）將上述步驟中剩余的 197ml 在 4℃下、 4000rpm 離心 15min。 4）誘導(dǎo)前，接出 1ml 未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照。g/mL Amp 的 LB 固體培養(yǎng)液， 37℃ 培養(yǎng) 24h。 7 結(jié)合緩沖液： NaH2PO4 NaCl Urea 8M 咪唑 20mM 洗脫緩沖液： NaH2PO4 NaCl Urea 8M 咪唑 碳酸鹽緩沖液（ pH ）： Na2CO3 NaHCO3 加去離子水 800mL，攪拌溶解，加入濃鹽酸調(diào) pH 至 ，最后定容到 1L。 氨芐抗性的篩選平板 主要試劑配方 12%分離膠： 蒸餾水 30% arcBis mL Tris(pH ) mL 10%SDS 180μL 10% Aps 180μL 6 TEMED 7μL 5%濃縮膠： 蒸餾水 30% arcBis 650μL Tris(pH ) 500μL 10%SDS 40μL 10% Aps 40μL TEMED 4μL 脫色液配制： 蒸餾 水 500ml 95%乙醇 40
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