【正文】 m搖床復(fù)蘇 45min。 （ 5）小心將上清液轉(zhuǎn)移到離吸附柱 Spin Column PA 中，靜置 2min，讓質(zhì)粒 DNA與吸附柱中的硅膠膜充分結(jié)合， 12， 000 離心 1min，棄收集管中的廢液。 20ul Proteinase K 溶液，混勻。 參見第二章 . 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 18 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 tanB、 talB、 gabT、 aroF編碼區(qū)序列的擴(kuò)增反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。 (1)挑取 wtBl21 菌加入到 5ml無抗 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)； (2) 取過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)基 200ul 加入到 10ml LB 培養(yǎng)基， 37℃ ， 200rpm 培養(yǎng)23hr，至 OD600～ ； (3) 制備感受態(tài) : I 在高速冷凍離心機(jī) 4176。L cas9 質(zhì)粒加入步驟 1 中的一管感受態(tài)中，小心混勻后將菌體全部轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中； (2) 1800V 電轉(zhuǎn)； (3) 立即向電轉(zhuǎn)杯中加入 1mL LB，之后全部轉(zhuǎn)入 EP管中，于。 4討論 圖 41 同源重組示意圖 線性片段是最終同源重組的關(guān)鍵，當(dāng)染色體基因被 cas9 基因所切割后，先行片段上的同源臂將與重組菌染色體上的基因進(jìn)行結(jié)合，然后我們想要改變的基因?qū)?huì)被線性片段所替換。 8. CB3 放回收集管中， 12， 000rpm（ ~13， 400Xg）離心 2min，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 置于溫室放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 15 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 1 材料 菌株和質(zhì)粒 1 表 31 菌株和質(zhì)粒 2 Table 31 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來源或文獻(xiàn) Source of reference Strains： E． coil DH5α MuBL21 Plamids： pGEMT vecter Cloning of bacteria MutyrA mutnaB mutalB mugabT mugabD mulplA mu aroF Cloning vector 博邁特 Biomed This lab promega 引物 根據(jù) muBL21 genome 序列，利用 serial cloner 分析軟件設(shè)計(jì)合成以下引物： 引物 序列 長(zhǎng)度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_up PF_gabD_up PF_gabT_up PF_talB_up PF_tnaB_up ATGCAAAAAGACGCGCTGAATAACGTACA ATGAAACTTAACGACAGTAACTTATTCCGC ATGAACAGCAATAAAGAGTTAATGCAGCG ATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCG ATGACTGATCAAGCTGAAAAAAAGCACTCT 29 30 29 26 30 67 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 16 PF_tyrA_up PF_lplA_up PR_lplA_down PR_aroF_down PR_gabD_down PR_gabT_down PR_tnaB_down PR_tyrA_down PR_talB_down ATGGTTGCTGAATTGACCGCATTACG ATGTCCACATTACGCCTGCTCATCT TTACCTTACCGCCCCCGCCATC TTAAGCCACGCGAGCCGTCAGC TTAAAGACCGATGCACATATATTTGATTTCTAAGTAA CTACTGCTTCGCCTCAGCAAAACACT TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTT TTACTGGCGGTTGTCATTCGCCTGA TTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC 26 25 22 22 37 26 33 25 28 66． 8 大腸桿菌培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計(jì) 2 方法 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 17 從 80℃ 保存的 muBL21 菌液中挑取少量接入 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng) 基因組提取 所用試劑盒為 TIANamp Bacteria DNA Kit，具體操作如下： 15ml， 10000rpm（ ~11， 500Xg）離心 1min，盡量吸凈上清。 （ 3）加入 250ul buffer P2，溫和顛倒混勻 6~8 次，直到溶液變得清亮粘稠。 （ 4） 13,000g離心 3 min，以去除柱中殘余乙醇。并盡量去除多余的凝膠。另外，科學(xué)家 研究發(fā)現(xiàn)， CRISPR 位點(diǎn)中間區(qū)的個(gè)數(shù)越多對(duì)噬菌體的抵抗力就越強(qiáng)。因此，科學(xué)家們推測(cè) CRISPR 與抗外來基因入侵的自主免疫作用有關(guān)。 TALEN 可以像 ZFN 那樣，對(duì)復(fù)雜懂得基因組進(jìn)行修飾，另外他的構(gòu)建簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，受到了諸多科研工作者的喜愛。但是同源重組技術(shù)仍有很有的弊端需要改進(jìn)，尤其是重組菌株的篩選與篩選基因的敲出，這個(gè)過程使得同源重組產(chǎn)生過程復(fù)雜、效率降低以及工作周期長(zhǎng)等弊端。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 4 red同源重組的 篩選以及標(biāo)記基因的剔除 雖然 Red 同源重組的效率很高，但是在同源重組過程中還是會(huì)有許多的菌落未重組成功，這就需要標(biāo)記基因的介入，就是將需要重組的基因連接在一個(gè)標(biāo)記基因上，將其一起同組到大腸桿菌的基因組。絕大部分對(duì)小鼠 ES 細(xì)胞基因打靶的結(jié)果對(duì)于人基因結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要意義。原來雙螺旋結(jié)構(gòu)中的 一個(gè)互補(bǔ)鏈拋充了另外的配對(duì)鏈， RecA 蛋白脫落。具體的操作方法包括同源重組與雜交等。這種方法簡(jiǎn)單易行，但獲得優(yōu)良菌種的幾率小，一般難以滿足生產(chǎn)的需要。 畢 業(yè) 論 文 設(shè)計(jì)題目 用同源重組的方法進(jìn)行基因修復(fù) I 目錄 摘要 .....................................................................................................................................i Abstract................................................................................................................................ ii 第一章 同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展 .........................................................................................1 1 前言 ..........................................................................................................................1 微生物育種技術(shù)概述 ...................................................................................1 同源重組技術(shù)發(fā)展 .......................................................................................2 Red 同源重組技術(shù) .......................................................................................3 CRISPR 介導(dǎo)基因的編輯技術(shù) ............................................................................4 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 ..................................................................................................8 1 材料 ..........................................................................................................................8 菌株和質(zhì)粒 .......................................................................................................8 培養(yǎng)基與常用溶液 ............................................................................................8 克隆中所用到的引物 .........................................................................................9 儀器 ................................................................................................................9 2 方法 ......................................................................................................................9 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 ............................................................................... 10 凝膠回收 ........................................................................................................ 10 gibson .......................................................................................................... 11 將質(zhì)粒 Ptarget 導(dǎo)入 DH5α中 ...................................................................... 11 ptarget 中 N20 的測(cè)序 ...................................................................................... 12 ptarget 質(zhì)粒提取 .............................................................................................. 12 3 結(jié)果分析 ............................................................................................................. 12 ptarget 質(zhì)粒