【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 uncture Structure) 的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前 聯(lián)會(huì) 體階段、 聯(lián)會(huì) 體形成和 Holliday 結(jié)構(gòu)的拆分。經(jīng)過(guò)生物技術(shù)演變，同源重組成為了將外源基因與受體染色體 NDA 上的同源序列之間發(fā)生互換，從而改變受體基因的特定序列，并最終改變基因的遺傳特性的方法 ［ 1］ 。并在基因檢測(cè)，重組基因表達(dá)方面有廣泛的應(yīng)用。 同源重組的發(fā)展史 在 1956 年，加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的 Clark 就對(duì) 的重組進(jìn)行了基因分析，并發(fā)現(xiàn)了與基因同源重組有關(guān)的酶 RecA 及 RecBCD。他們發(fā)現(xiàn)RecA 蛋白質(zhì)有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)，分別與單鏈擠雙鏈 DNA 結(jié)合，在試管里能從某些小病毒里提取的單鏈 DNA 結(jié)合，這樣以來(lái)，包裹著蛋白質(zhì)的 DNA 就會(huì) “侵犯 ”完整的雙螺旋 DNA，把它的互補(bǔ)鏈分開(kāi)，這個(gè)包裹蛋白質(zhì)的鏈不斷的試探著雙螺旋結(jié)構(gòu)，直到找到與它同源互補(bǔ)的序列，他就會(huì)插入到 DNA 的雙鏈中，形成一個(gè)三鏈結(jié)構(gòu)，如果有足夠長(zhǎng)的同源重組的序列， RecA 就會(huì)被激活為一個(gè)交換型結(jié)構(gòu)，催化鏈交換反應(yīng)，最終形成一個(gè)新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。原來(lái)雙螺旋結(jié)構(gòu)中的 一個(gè)互補(bǔ)鏈拋充了另外的配對(duì)鏈， RecA 蛋白脫落。由此而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)叫做 “D 環(huán) ”。RecBCD 蛋白的功能是從 DNA 雙鏈的一段進(jìn)入往 DNA 的另一端運(yùn)動(dòng)，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中他會(huì)將 DNA 的雙鏈分開(kāi)，并與此同時(shí)將分開(kāi)的兩個(gè) DNA 單鏈絞在一起。但是它的聚合速度比分離速度要慢，所以最終將會(huì)在 DNA 的兩側(cè)各形成一個(gè)不斷增大單鏈 DNA 的環(huán)。在某些情況下， RecBCD 蛋白質(zhì)不僅把 DNA 鏈分開(kāi)，而且將他們切開(kāi)。生化實(shí)驗(yàn)表明： RecBCD 蛋白質(zhì)使一段單鏈 DNA 和所在染色體分北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 3 開(kāi)，在 RecA 蛋白質(zhì)的幫助在，這根自由的鏈和另一個(gè)染色體的一根鏈上的互補(bǔ)序列形成一個(gè)新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 由于同源重組能按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因代替數(shù)對(duì)于研究基因結(jié)構(gòu)與功能及表達(dá)調(diào)控具有極重要意義，通過(guò)定點(diǎn)突變而改變單個(gè)堿基或幾個(gè)堿基導(dǎo)致核苷酸序列發(fā)生改變，從而改變?cè)摶虻墓δ?。例如，如果我們推測(cè)在弄得發(fā)育過(guò)程中包括有某一特殊基因的作用，這樣我們通過(guò)基因打靶將正?；?“knock out”，而代之以錯(cuò)誤的基因，這樣導(dǎo)致正?；虻耐耆Щ?，如果具有這中基因結(jié)構(gòu)的新生鼠有畸形的 小腦，則我們可以確定這個(gè)基因是小腦發(fā)育正常所必需的基因。絕大部分對(duì)小鼠 ES 細(xì)胞基因打靶的結(jié)果對(duì)于人基因結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要意義。 Red同源重組技術(shù) red同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展 Red 重組系統(tǒng)是一種基于噬菌體 Red 重組酶的同源重組系統(tǒng)， Red 同源重組系統(tǒng)由三種蛋白組合： EXO 蛋白是核酸外切酶，結(jié)合在雙鏈 DNA 的末端，從 5’端向 3’端降解 DNA，產(chǎn)生 3’突出端， Beta 蛋白結(jié)合在單鏈 DNA 上介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA 退火， gam蛋白可與 RecBCD 酶結(jié)合抑制其降解外源 DNA 的活性， Red 同源重組技術(shù) 具有同源序列端、重組效率高的特點(diǎn)。 Red 同源重組技術(shù)的原理是將一段攜帶與靶基因兩翼各有 40~60bp 同源序列的 PCR 片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，利用 K 噬菌體 Red 重組酶的作用是導(dǎo)入細(xì)胞的線性 DNA 片段與染色體的特定扒啊序列進(jìn)行同源重組，靶基因被標(biāo)記基因置換下來(lái)。 ［ 2］ PCR引物由兩部分組成，靠近 5c端的區(qū)域?yàn)榕c把基因同源的序列（約 40bp），靠近 3c 端的區(qū)域（約 20bp） 與模版 DNA 互補(bǔ)。這種重組技術(shù)是最近發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)可在染色體水平上進(jìn)行遺傳操作的新技術(shù)，只需較短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位點(diǎn)，即可在生物體內(nèi)完成重組過(guò)程，省去了體外 DNA 酶切、連接等步驟。這樣，靶基因兩翼序列已知的條件下就可以通過(guò) Red 重組技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行跳出、敲入、點(diǎn)突變等操作，還可在靶基因的上下有加入適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和中只字序列一條街基因的表達(dá)。將含有 ori 復(fù)制序列的線性載體片段導(dǎo)入細(xì)胞，也可將靶基因克隆于載體上。實(shí)驗(yàn)證明，這種基因打靶技術(shù)是基因功能研究和新菌株構(gòu)建的有力工具。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 4 red同源重組的 篩選以及標(biāo)記基因的剔除 雖然 Red 同源重組的效率很高，但是在同源重組過(guò)程中還是會(huì)有許多的菌落未重組成功，這就需要標(biāo)記基因的介入，就是將需要重組的基因連接在一個(gè)標(biāo)記基因上，將其一起同組到大腸桿菌的基因組。但是大腸桿菌中攜帶標(biāo)記基因，這樣就可能對(duì)重組菌以后的表達(dá)產(chǎn)生影響，所以標(biāo)記基因的剔除也是同源重組中至關(guān)重要的一步。 一般通過(guò)以下四種方法完成標(biāo)記基因的剔除： （ 1）如果線性 DNA 中含有 ori 基因那么，可以一步篩選法將中間為篩選基因兩端為同源序列的標(biāo)記基因重組下來(lái)。 （ 2）篩選和反向篩選的結(jié)合使用，在第一步同源重組過(guò)程將兩個(gè)標(biāo)記基因?qū)氲捷d體上，然后通過(guò)正向基因?qū)⑵浜Y選出來(lái)，然后進(jìn)行第二補(bǔ)同源重組，用反向標(biāo)記基因篩選出重組成功的基因。 （ 3）篩選與位點(diǎn)特異性重組的結(jié)合，把篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)加上 FLP 位點(diǎn)，F(xiàn)LP 位點(diǎn)具有特異性同組酶識(shí)別的作用。應(yīng)用此方法有一個(gè)缺點(diǎn)就是會(huì)在基因上留下 34 或 36bp 的特殊序列。 （ 4）篩選和限制性內(nèi)切反應(yīng)的結(jié)合，和第三種方法類似在標(biāo)記基因的兩次加上限制性酶切位點(diǎn)，然后利用酶切反應(yīng)將標(biāo)記基因切除。 CRISPR介導(dǎo)基因的編輯技術(shù) CRISPR介導(dǎo)基因的編輯技術(shù)的研究進(jìn)展 基因打靶，尤其是同源重組技術(shù)出現(xiàn)之后，無(wú)論是在科學(xué)研究，還是在工業(yè)生產(chǎn)上都有了革命性的變革。但是同源重組技術(shù)仍有很有的弊端需要改進(jìn)，尤其是重組菌株的篩選與篩選基因的敲出，這個(gè)過(guò)程使得同源重組產(chǎn)生過(guò)程復(fù)雜、效率降低以及工作周期長(zhǎng)等弊端。一種人工核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀。 ［ 3］ 鋅指核酸內(nèi)切酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是人類所創(chuàng)造的第一代核酸內(nèi)切酶，鋅指是指的一類能夠結(jié)合 DNA 的蛋白質(zhì)，人類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子中幾乎有一半含有鋅指結(jié)構(gòu)， ZFN 是將鋅指蛋白和核酸內(nèi)切酶 Fok1 融合形成的核酸內(nèi)切酶，利用他能夠在各種復(fù)雜基因組的特定位置創(chuàng)造 DNA 的雙鏈切口的這一特性。它應(yīng)用于黑長(zhǎng)尾猴、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、煙草、人類 ips 細(xì)胞甚至 HIV 的藥物生產(chǎn)。不過(guò) ZFN 不是那么完美，它也有一些弊端，比如制備復(fù)雜，成本昂貴，最重要的是其專利被少數(shù)幾個(gè)商業(yè)公司所控制，這樣就會(huì)限制它在科研與生產(chǎn)方面的應(yīng)用。后來(lái)，第二代人工核酸酶 ——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶，它的出現(xiàn)在北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 5 一定程度上替代了 ZFN。 20xx 年，科學(xué)家將一種水稻的致病菌編碼的累轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物與 DNA 的 堿基進(jìn)行了對(duì)應(yīng)解密。 20xx 年， TALEN 蛋白在成功應(yīng)用于酵母之中。 TALEN 可以像 ZFN 那樣，對(duì)復(fù)雜懂得基因組進(jìn)行修飾，另外他的構(gòu)建簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，受到了諸多科研工作者的喜愛(ài)。 ZFN 和 TALEN 的工作原理相同，都是將 DNA 蛋白與核酸內(nèi)切酶 Fok1 融合而成。 20xx 年， CRISPR/cas9 出現(xiàn)，它主要根據(jù)大腸桿菌的自主免疫，然后將已有的基因進(jìn)行改造而成。其具有制備簡(jiǎn)單、成本低、作用高效等特點(diǎn)。 CRISPR 序列是由日本科學(xué)家在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的 ［ 4］ ,但是這段序列的功能無(wú)法被當(dāng)時(shí)的科學(xué)界確定，因此它一直 沒(méi)有受到有關(guān)科研人員的重視， 1995 年，西班牙的科學(xué)家們?cè)诘刂泻O嗜鹽菌和沃爾卡尼極嗜鹽菌的研究中第二次發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)構(gòu)，之后，此結(jié)構(gòu)也被陸續(xù)報(bào)道，但是直到多種細(xì)菌的基因組測(cè)序完成之后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)在細(xì)菌和古生菌中存在非常的廣泛?？茖W(xué)工作者便開(kāi)始對(duì)其的研究，并將其正式命名為 CRISPR。 1987 年， CRISPR 被發(fā)現(xiàn)之后，它的作用一直以來(lái)就是一個(gè)謎團(tuán)，不曾被人們破解，不過(guò)對(duì)著人們分子生物學(xué)研究方法的日益成熟，人們對(duì)基因序列的認(rèn)識(shí)更加的廣闊，以及大量的病毒和質(zhì)粒的遺傳信息的記錄整理， CRISPR 序列的功能最終被發(fā)現(xiàn)。 20xx 年，有 3 個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了 CRISPR 序列中的間隔序列與宿主菌的染色體外遺傳物質(zhì)的高度的相似。因此，科學(xué)家們推測(cè) CRISPR 與抗外來(lái)基因入侵的自主免疫作用有關(guān)。根據(jù)這個(gè)推測(cè)科學(xué)家們開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行這一方面的研究，隨后便發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的 CRISPR 可以對(duì)抗噬菌體的入侵，以及外來(lái)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并用實(shí)驗(yàn)證明了這一理論。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 6 CRISPR的原理 圖 11 CRISPR 工作原理 CRISPR/cas9 基因編輯技術(shù)是 ZFN 和 TALEN 之后迅速發(fā)展起來(lái)的第三代基因編輯技術(shù)，該技術(shù)是細(xì)菌以及古生菌中存在的 Ⅱ 型 CRISPR/Cas 基因進(jìn)行改造而形成的。它可以針對(duì)噬箘體感染、質(zhì)粒接合所造成的基因侵入而形成的特異性的防御。該過(guò)程分為 3 個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾。 （ 1） 適應(yīng) 當(dāng)噬菌體 DNA 侵入菌體時(shí)， CRISPR 系統(tǒng)就會(huì)知道合成 cas 蛋白， cas 蛋白將對(duì)其 DNA 進(jìn)行切割，使其形成無(wú)數(shù)個(gè) 30bp 左右的 DNA 片段。然后將其整合到 CRISPR 導(dǎo)向序列之后重復(fù)序列之前的位置，使其形成一個(gè)新的 spacer。每次插入都伴隨這重復(fù)序列的復(fù)制，這樣就可以保證 CRISPR 中存在次噬菌體的序列信息，為適應(yīng)性免疫做基礎(chǔ)。另外，科學(xué)家 研究發(fā)現(xiàn)， CRISPR 位點(diǎn)中間區(qū)的個(gè)數(shù)越多對(duì)噬菌體的抵抗力就越強(qiáng)。 （ 2） 表達(dá) 當(dāng)同類噬菌體再次入侵該宿主菌時(shí)， CRISPR 位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平就會(huì)迅速上升，生成重復(fù)序列和間區(qū)的前體 precrRNA，之后被 cas 蛋白切成更小的 crRNA，即成熟的 1 個(gè)間隔序列和部分的重復(fù)序列。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 7 每段的邊距保持一致 （ 3） 干擾： crRNAs 干擾入侵核酸 crRNP 將會(huì)通過(guò) crRNA 迅速尋找與其互補(bǔ)的 DNA 片段，并進(jìn)行特異性結(jié)合，然后在復(fù)合體的作用下將其降解，從而達(dá)到保護(hù)宿主菌的作用。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 8 第二章 質(zhì)粒 ptarget的構(gòu)建 1 材料 表 11 菌株和質(zhì)粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來(lái)源或文獻(xiàn) Source of reference Strains： E． coil DH5α Plamids： PtargetlacZ Cloning of bacteria 博邁特 Biomed This lab 1． LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g TE（ ）： 10mmol/L trisHCL () 1mmol/L EDTA () 1XTAE： 40mmol/L trisCH3COOH 1 mmol/L EDTA Gel safe 溶膠液 1000ml 100ul gel safe 定溶至 1000ml 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 9 、試劑和試劑盒 生化與分子生物學(xué)試劑購(gòu)自原平浩試劑公司、上海生工生物公司、鼎國(guó)生物公司： taq 酶及 PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自 TAKARA 公司，化學(xué)試劑為分析純， PCR 引物由中美泰合合成。 核酸回收試劑盒 QLAEX Ⅱ 購(gòu)自 Qiagen。 根據(jù) wtBL21 上的突變位點(diǎn)，利用 serial cloner 分析軟件設(shè)計(jì)合成下列引物： 引物 序列 長(zhǎng)度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_apc PF_gabD(2)_spc PF_gabD_spc PF_gabT_spc PF_lplA_spc PF_talB_spc PF_tnaB