【正文】 d aroF genes of artptreated B8 strains into wild type B8 strains, then recorded the growth curve of the mutants and rebinants, and quantitatively analyzed the tryptophan production of them. Keywords： homologous rebination， B8， CRISPR北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 1 第一章 同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展 1 前言 微生物育種技術(shù)概述 優(yōu)良的菌株作為工業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，所以獲得優(yōu)良的菌株對于生物發(fā)酵或者產(chǎn)品生產(chǎn)都是至關(guān)重要，獲得優(yōu)良的菌株主要包括選種與育種兩個(gè)過程，首先是選種，選種就是從天然的菌株中找到可以得到我們需要的生物分子或是有優(yōu)良的生物特性的菌株，然后是育種，對已有的菌株進(jìn)行遺傳改良。 （ 2） 誘變育種 以誘發(fā)基因突變?yōu)槭侄蔚奈⑸镉N技術(shù)。如 1943 年從自然界分離到的青霉素產(chǎn)生菌的效價(jià)只有20 單位 /毫升，經(jīng)過一系列的誘變育種后，效價(jià)已達(dá) 40000 單位 /毫升； 金霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，發(fā)酵液中又積累了去甲基金霉素；谷氨酸棒桿菌 1299 經(jīng)紫外線誘變后，有的能產(chǎn)賴氨酸，有的能產(chǎn)纈氨酸，增加了產(chǎn)品的種類；土霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發(fā)酵罐的利用率。 同源重組技術(shù)發(fā)展 同源重組定義 傳統(tǒng)意義上的同源重組指的是，發(fā)生在非 姐妹染色單體 （ sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的 DNA 分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。并在基因檢測，重組基因表達(dá)方面有廣泛的應(yīng)用。由此而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)叫做 “D 環(huán) ”。生化實(shí)驗(yàn)表明： RecBCD 蛋白質(zhì)使一段單鏈 DNA 和所在染色體分北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 3 開，在 RecA 蛋白質(zhì)的幫助在，這根自由的鏈和另一個(gè)染色體的一根鏈上的互補(bǔ)序列形成一個(gè)新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 Red同源重組技術(shù) red同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展 Red 重組系統(tǒng)是一種基于噬菌體 Red 重組酶的同源重組系統(tǒng)， Red 同源重組系統(tǒng)由三種蛋白組合： EXO 蛋白是核酸外切酶，結(jié)合在雙鏈 DNA 的末端，從 5’端向 3’端降解 DNA，產(chǎn)生 3’突出端， Beta 蛋白結(jié)合在單鏈 DNA 上介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA 退火， gam蛋白可與 RecBCD 酶結(jié)合抑制其降解外源 DNA 的活性， Red 同源重組技術(shù) 具有同源序列端、重組效率高的特點(diǎn)。這樣，靶基因兩翼序列已知的條件下就可以通過 Red 重組技術(shù)對該基因進(jìn)行跳出、敲入、點(diǎn)突變等操作，還可在靶基因的上下有加入適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和中只字序列一條街基因的表達(dá)。但是大腸桿菌中攜帶標(biāo)記基因，這樣就可能對重組菌以后的表達(dá)產(chǎn)生影響，所以標(biāo)記基因的剔除也是同源重組中至關(guān)重要的一步。應(yīng)用此方法有一個(gè)缺點(diǎn)就是會(huì)在基因上留下 34 或 36bp 的特殊序列。一種人工核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀。后來，第二代人工核酸酶 ——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶，它的出現(xiàn)在北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 5 一定程度上替代了 ZFN。 ZFN 和 TALEN 的工作原理相同，都是將 DNA 蛋白與核酸內(nèi)切酶 Fok1 融合而成?？茖W(xué)工作者便開始對其的研究，并將其正式命名為 CRISPR。根據(jù)這個(gè)推測科學(xué)家們開始對其進(jìn)行這一方面的研究，隨后便發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的 CRISPR 可以對抗噬菌體的入侵，以及外來質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并用實(shí)驗(yàn)證明了這一理論。 （ 1） 適應(yīng) 當(dāng)噬菌體 DNA 侵入菌體時(shí)， CRISPR 系統(tǒng)就會(huì)知道合成 cas 蛋白， cas 蛋白將對其 DNA 進(jìn)行切割，使其形成無數(shù)個(gè) 30bp 左右的 DNA 片段。 （ 2） 表達(dá) 當(dāng)同類噬菌體再次入侵該宿主菌時(shí)， CRISPR 位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平就會(huì)迅速上升，生成重復(fù)序列和間區(qū)的前體 precrRNA，之后被 cas 蛋白切成更小的 crRNA，即成熟的 1 個(gè)間隔序列和部分的重復(fù)序列。 根據(jù) wtBL21 上的突變位點(diǎn)，利用 serial cloner 分析軟件設(shè)計(jì)合成下列引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_apc PF_gabD(2)_spc PF_gabD_spc PF_gabT_spc PF_lplA_spc PF_talB_spc PF_tnaB_spc PF_tyrA_spc TCCTAGGTATAATActagtCCCGGCGATAATATCTGAAAgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtTGTGGTTTGCGGCGGTAAAGgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCAACTGGTTCAATTTGTTGAgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCGGACGCAAAACTCACCGCCgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCAAGTCTGGCGTTTTGTCCGgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtGCCAGCTCTTTCAGCAGTGTgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtCGAACTTATCCACAATACGCgttttagagctagaaatagc TCCTAGGTATAATActagtGCCATGCTGGCGGCGCACGAgttttagagctagaaatagc 59 59 59 59 59 59 59 59 儀器 C1000 PCR 儀 2 方法 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 10 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 Ptarget 質(zhì)粒的 PCR Q5 反應(yīng)體系 100ul 體系 5*Q5 reaction buffer 20ul 10mM dNTP 2ul 10uM Fprimer 5ul 10uM Rprimer 5ul DNA Template 1pg~1ng Q5 DNA polymerase 1ul 5*High GC enhancor 20ul ddH2O 47ul 反應(yīng)條件 98℃ 預(yù)變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 47℃ 退火溫度 30s 72℃ 延伸 30s 4 個(gè)循環(huán)后 98℃ 變性 10s 62℃ 退火 30s 72℃ 延伸 50s 30 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 5min 4℃ 保存 for ever 將 PCR 產(chǎn)物中加入 5ul 5 X solution buffer 后，調(diào)節(jié)電壓 150V，電流 130A，點(diǎn)擊 star，開始電泳。 （ 1）將切割的凝膠轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的 ，加入等體積的 Buffer GL(100mg的凝膠加入 100μl Buffer I)。目的 DNA 長度 ≤500bp時(shí)，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入 DNA 純化柱中，離心。 （ 5）將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在 60℃ 下預(yù)熱的 30μl ddH2O，室溫放置 12min或更長時(shí)間。 37℃ 過夜培養(yǎng)。 （ 4）加入 350ul buffer P3 立即溫和顛倒混勻 6~8 次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，溫室靜置 2min，然后 12， 000rpm，離心 5min。 （ 9）將離心吸附柱 Spin Column PA 置于一個(gè)新的 管中，加入去離子水30ul，室溫放置 2min， 120xxrpm離心 1min。 200ul緩沖液 GA，震蕩至菌體徹底懸浮。 CB3 中（吸附柱放入收集管中）， 120xxrpm（ ~13， 400Xg）離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50ul 去離子水。將活化后的細(xì)胞涂布至 amp 抗性的 LB 平板上過夜培養(yǎng)。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 22 第四章 基因同源重組 1材料 菌體和質(zhì)粒 表 11 菌株和質(zhì)粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來源或文獻(xiàn) Source of reference Strains： E． coil DH5α WtBL21 Plamids： PtargetaroF PtargetlplA PtargetgabD PtargetgabT PtargettalB PtargettnaB PtargettyrA Cloning of bacteria 博邁特 Biomed This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab 1． LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 23 1TAE 溶液 50TAE 20ml 定溶至 1000ml 50TAE 溶液 Tris 242g EDTA 冰醋酸 定溶至 1000ml 驗(yàn)證引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_test PF_gabD_test PF_gabT_test PF_talB_test PF_tnaB_test PF_tyrA_test PF_lplA_test PR_lplA_test PR_aroF_test PR_gabD_test PR_gabT_test PR_tnaB_test PR_tyrA_test PR_talB_test CAGATTGCTGACTCGCGTAAAAGC CCCTTTCCAGCCGACAGTGG GGTGAAGCCATCGACGTCACC GTCCTGCACATACAGGCGGTTG CTGCATCCGAAGGTGGTGGCC GCCAGCAATCCGTCTTTCAACTTCTG GGCATTACGTCGGTACGTTCCC CATCCATGCCGATAACTCCCGTAG GCAACGATCGTATTCTGATCAAACTGGC CGCCAGCTCTTTCAGCAGTGCC TCTGCGCGACGCCACCAGCTC CTCGCGGAATATTCCCCATGGTGC GACCCTCTCGGGTTATCAGGTG GTAGCCCCAGCACCGGACC 24 20 21 22 21 26 22 24 28 22 21 24 22 19 67 66． 8 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計(jì) 電轉(zhuǎn)儀 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 24 2 方法 wtBL21感受態(tài)的制備 準(zhǔn)備工作：滅菌 ddH2O 或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 15%甘油預(yù)先置于冰上至少 2hr； 預(yù)冷離心機(jī)。重復(fù) 3 次； III 用 120