【正文】 的構(gòu)建 .......................................................................................... 12 N20 測序?qū)?比 ................................................................................................. 13 4 討論 ......................................................................................................................... 14 第三章 基因組片段的獲取與驗證 ....................................................................................... 15 1 材料 ........................................................................................................................ 15 菌株和質(zhì)粒 .................................................................................................... 15 引物 .............................................................................................................. 15 大腸桿菌培養(yǎng)基 ............................................................................................. 16 儀器 .............................................................................................................. 16 2 方法 ........................................................................................................................ 16 細菌基因組的分離 .......................................................................................... 17 PCR 反應體系與反應條件 ............................................................................... 18 DNA片段的回收與純化 .................................................................................. 19 T 克隆的反應體系 與反應條件 ......................................................................... 19 化學轉(zhuǎn)化 ....................................................................................................... 20 T—clone vector 的菌落驗證 PCR 反應體系與反應條件 ..................................... 20 3 結(jié)論與分析 ............................................................................................................. 20 muBL21 基因組 DNAtyrA、 tnaB、 talB、 gabD、 gabT 基因的驗證 ................ 20 4 討論 ......................................................................................................................... 21 II 第四章 基因同源重組 ................................................................................................. 22 1 材料 ......................................................................................................................... 22 菌體和質(zhì)粒 ............................................................................................... 22 培養(yǎng)基與常用溶液 .......................................................................................... 22 常用溶液與試劑 ........................................................................................... 23 引物 ............................................................................................................... 23 儀器 .............................................................................................................. 23 2 方法 ........................................................................................................................ 24 wtBL21 感受態(tài)的制備 .............................................................................. 24 cas9 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 ..................................................................................... 24 wtBL21/cas9 感受態(tài)的制備 ............................................................................ 24 各基因片段的同源重組 .................................................................................. 25 重組驗證菌落 PCR 的反應體系與反應條件 ..................................................... 25 同源重組成功的單克隆的獲取 ........................................................................ 26 Ptarget和 cas9 質(zhì)粒的去除 .............................................................................. 28 3 結(jié)果與分析 .......................................................................................................... 28 4．討論 ...................................................................................................................... 29 第五章 回補基因?qū)w生長和色氨酸生產(chǎn)的影響 .............................................................. 30 1 材料 ........................................................................................................................ 30 菌種和質(zhì)粒 ..................................................................................................... 30 2 方法 ........................................................................................................................ 30 RBS8 質(zhì)粒的擴增 ........................................................................................... 30 mutB8/mutRBS8 中 mutRBS8 質(zhì)粒的剔除 ..................................................... 31 BL2 mutB wtB holoB8 感受態(tài)的制備 ............................................. 31 RBS8 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 ........................................................................................ 31 校正曲線制作 ................................................................................................. 31 wtBL holoBL8 和 BL21 生長曲線的對比 ................................................... 31 色氨酸含量的測定 ......................................................................................... 32 3 結(jié)果分析 ................................................................................................................. 32 4 討論 ......................................................................................................................... 35 參考文獻 ........................................................................................................................... 36 致謝 .................................................................................................................................. 37 i 摘要 誘變育種是工業(yè)上獲得性能優(yōu)良的菌株的必要手段，但是在對表達載體進行生物誘變時，就會不可避免的造成工程菌本身染色體的變異，為研究這些染色體的變異對工程菌本身的影響，本實驗使用同源重組技術(shù)對通過 artp誘導突變的 BL8（ BL21表達菌敲出 3個基因后的工程菌）工程菌進行基因替換 ,并以色氨酸定位研究對象，觀察其產(chǎn)率上變化，對其突變堿基對色氨酸的產(chǎn)量的影響進行了初步研究。 （ 1） 自然育種 對自然界中的微生物，在未經(jīng)人工誘變或雜交處理的情況下進行分離和純化（見微生物的