【正文】 5 年，西班牙的科學家們在地中海極嗜鹽菌和沃爾卡尼極嗜鹽菌的研究中第二次發(fā)現這個結構，之后，此結構也被陸續(xù)報道，但是直到多種細菌的基因組測序完成之后，科學家發(fā)現這種串聯重復結構在細菌和古生菌中存在非常的廣泛。該過程分為 3 個階段：適應、表達和干擾。 核酸回收試劑盒 QLAEX Ⅱ 購自 Qiagen。 13,000g離心 1 分鐘，棄廢液。 （ 8） 用移液槍將細胞懸浮后，將細胞懸液加入到含有 spe 抗性的 LB 平板，涂布。 （ 7）重復步驟 6 操作一次 （ 8）溫室 12， 000rpm離心 2min，甩干殘留液體。 220ul無水乙醇，充分震蕩混勻 15sec，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。 T克隆的反應體系與反應條件 T克隆第一步加 A的反應體系與反應條件 反應體系： Taq 聚合酶反應體系 25ul easy Taq mix DNA template(20ng/ul) 反應條件： 94℃ 預變性 5min 72℃ 總延伸 20min T克隆第二步加 T的反應體系和反應條件 反應體系： Takara DNA ligation Kit （ mighty Mix=takara code ） Tvector PMD19 1ul PCR product 1ul dH2O 3ul Mighty MIx 5ul 反應條件： 16℃ 連接 forever 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗證 20 化學轉化 在 DH5α細胞中加入 3ul PMD19 質粒，方法參見第二章 。C 條件下 6000rpm離心 5min，倒去上清夜。L 質量分數為 15%甘油溶液溶解，并置于 80℃ 超低溫冰箱凍存。 T—clone vector的菌落驗證 PCR反應體系與反應條件 反應體系： Taq聚合酶反應體系 10ul體系 Taq 聚合酶 dNTP 10*reactionbuffer 1ul DNAtemplate 200ng 反應條件： 94℃ 預變性 DNA 5min 98℃ 變性 30s 61℃ 退火 30s 72℃ 延伸 2： 30s 34 個循環(huán)后 72℃ 補充延伸 2min 4℃ 保存 forever 3 結論與分析 muBL21基因組 DNAtyrA、 tnaB、 talB、 gabD、 gabT基因的驗證 由于將基因組進行 T 克隆的效率有限，而且 PMD19 的空質粒在 amp 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗證 21 圖 31 T克隆驗證膠圖 1： lplA 2： talB 3： 1 kb plus marker 4： gabD 5： tyrA 6： gabT 7： aroF 8： tnaB 抗性的 LB 平板上仍然可以生長，所以本實驗在進行基因測序之前，進行了 pcr驗證，電泳。 CB3 中加入 500ul 緩沖液 GD， 12， 000rpm（ ~13， 400Xg）離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中。 3 結果分析 ptarget質粒的構建 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第二章 質粒 ptarget 的構建 13 利用實驗前設計的引物對已有的 ptargetlacZ 進行 PCR 擴增，然互 圖 11 ptarget 的 PCR 驗證 圖 12ptarget 的 PCR 驗證 圖 11 1:ptargettanB 2:ptargettalB 3:ptargetaroF 4:ptargettyrA 5： ptargetgabT 6：1kb plus maker 7： ptargetgabD（ 2） 8： ptargetgabD 9： ptargetlplA 圖 12 1： ptargetlplA 2： ptargetgabT 3： ptargettyrA 將 PCR 產生的兩個條帶進行 gibson 連接，然后將連接產物進行 PCR 驗證，由于第一次實驗 PCR 條件出現問題故做了第二次 PCR。 ptarget中 N20的測序 將含有 ape 抗性的 LB平板上的單菌落接種與加有 ape 抗性的 5ul LB 液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2h，將其送至博尚生物公司測序。 在 DNA 純化柱中加入 650μl Wash Buffer， 13,000g離心 30 秒，棄廢液，將 DNA純化柱放回收集管。 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第二章 質粒 ptarget 的構建 11 ： 配置瓊脂糖凝膠，電泳以分離 dna 片段，任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用。然后將其整合到 CRISPR 導向序列之后重復序列之前的位置，使其形成一個新的 spacer。 1987 年， CRISPR 被發(fā)現之后，它的作用一直以來就是一個謎團，不曾被人們破解，不過對著人們分子生物學研究方法的日益成熟，人們對基因序列的認識更加的廣闊，以及大量的病毒和質粒的遺傳信息的記錄整理， CRISPR 序列的功能最終被發(fā)現。 20xx 年，科學家將一種水稻的致病菌編碼的累轉錄激活因子效應物與 DNA 的 堿基進行了對應解密。 （ 4）篩選和限制性內切反應的結合，和第三種方法類似在標記基因的兩次加上限制性酶切位點，然后利用酶切反應將標記基因切除。將含有 ori 復制序列的線性載體片段導入細胞，也可將靶基因克隆于載體上。 由于同源重組能按實驗設計進行基因的定點突變，由此產生的轉基因代替數對于研究基因結構與功能及表達調控具有極重要意義，通過定點突變而改變單個堿基或幾個堿基導致核苷酸序列發(fā)生改變，從而改變該基因的功能。 同源重組的發(fā)展史 在 1956 年，加利福尼亞大學伯克利分校的 Clark 就對 的重組進行了基因分析，并發(fā)現了與基因同源重組有關的酶 RecA 及 RecBCD。誘變育種的不足是缺乏定向性。育種主要包括自然育種與人工育種兩個方面。 同源重組是基因工程實驗中常用的技術手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用，而 red（一種能夠應用于大腸桿菌的基于 λ噬菌體 Red重組酶的同源重組系統(tǒng)）同源重組技術是利用 red系統(tǒng)是一項可在染色體水平進行遺傳操作的技術，只需要較短的同源序列而不需要特定的限制性酶切位點，即可完成。 （ 2） 誘變育種 以誘發(fā)基因突變?yōu)槭侄蔚奈⑸镉N技術。 同源重組技術發(fā)展 同源重組定義 傳統(tǒng)意義上的同源重組指的是，發(fā)生在非 姐妹染色單體 （ sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的 DNA 分子之間或分子之內的重新組合。由此而產生的結構叫做 “D 環(huán) ”。 Red同源重組技術 red同源重組技術的研究進展 Red 重組系統(tǒng)是一種基于噬菌體 Red 重組酶的同源重組系統(tǒng)， Red 同源重組系統(tǒng)由三種蛋白組合： EXO 蛋白是核酸外切酶，結合在雙鏈 DNA 的末端，從 5’端向 3’端降解 DNA，產生 3’突出端， Beta 蛋白結合在單鏈 DNA 上介導互補單鏈DNA 退火， gam蛋白可與 RecBCD 酶結合抑制其降解外源 DNA 的活性， Red 同源重組技術 具有同源序列端、重組效率高的特點。但是大腸桿菌中攜帶標記基因，這樣就可能對重組菌以后的表達產生影響，所以標記基因的剔除也是同源重組中至關重要的一步。一種人工核酸內切酶的出現改變了這一現狀。 ZFN 和 TALEN 的工作原理相同，都是將 DNA 蛋白與核酸內切酶 Fok1 融合而成。根據這個推測科學家們開始對其進行這一方面的研究，隨后便發(fā)現細菌中的 CRISPR 可以對抗噬菌體的入侵，以及外來質粒的轉移，并用實驗證明了這一理論。 （ 2） 表達 當同類噬菌體再次入侵該宿主菌時， CRISPR 位點的轉錄水平就會迅速上升，生成重復序列和間區(qū)的前體 precrRNA，之后被 cas 蛋白切成更小的 crRNA，即成熟的 1 個間隔序列和部分的重復序列。 （ 1）將切割的凝膠轉入預先稱重的 ，加入等體積的 Buffer GL(100mg的凝膠加入 100μl Buffer I)。 （ 5）將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在 60℃ 下預熱的 30μl ddH2O，室溫放置 12min或更長時間。 （ 4）加入 350ul buffer P3 立即溫和顛倒混勻 6~8 次，可見白色沉淀物產生，溫室靜置 2min，然后 12， 000rpm，離心 5min。 200ul緩沖液 GA，震蕩至菌體徹底懸浮。 CB3 轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50ul 去離子水。北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 22 第四章 基因同源重組 1材料 菌體和質粒 表 11 菌株和質粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和質粒 Strains and plamids 基因型或表現型 Genotype or phenotype 來源或文獻 Source of reference Strains： E． coil DH5α WtBL21 Plamids： PtargetaroF PtargetlplA PtargetgabD PtargetgabT PtargettalB PtargettnaB PtargettyrA Cloning of bacteria 博邁特 Biomed This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab 1． LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 23 1TAE 溶液 50TAE 20ml 定溶至 1000ml 50TAE 溶液 Tris 242g EDTA 冰醋酸 定溶至 1000ml 驗證引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_test PF_gabD_test PF_gabT_test PF_talB_test PF_tnaB_test PF_tyrA_test PF_lplA_test PR_lplA_test PR_aroF_test PR_gabD_test PR_gabT_test PR_tnaB_test PR_tyrA_test PR_talB_test CAGATTGCTGACTCGCGTAAAAGC CCCTTTCCAGCCGACAGTGG GGTGAAGCCATCGACGTCACC GTCCTGCACATACAGGCGGTTG CTGCATCCGAAGGTGGTGGCC GCCAGCAATCCGTCTTTCAACTTCTG GGCATTACGTCGGTACGTTCCC CATCCATGCCGATAACTCCCGTAG GCAACGATCGTATTCTGATCAAACTGGC CGCCAGCTCTTTCAGCAGTGCC TCTGCGCGACGCCACCAGCTC CTCGCGGAATATTCCCCATGGTGC GACCCTCTCGGGTTATCAGGTG GTAGCCCCAGCACCGGACC 24 20 21 22 21 26 22 24 28 22 21 24 22 19 67 66． 8 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計 電轉儀 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 24 2 方法 wtBL21感受態(tài)的制備 準備工作：滅菌 ddH2O 或質量分數為 15%甘油預先置于冰上至少 2hr； 預