【導(dǎo)讀】設(shè)計(jì)題目用同源重組的方法進(jìn)行基因修

　　

【正文】 ATATATTTGATTTCTAAGTAA CTACTGCTTCGCCTCAGCAAAACACT TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTT TTACTGGCGGTTGTCATTCGCCTGA TTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC 26 25 22 22 37 26 33 25 28 66． 8 大腸桿菌培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計(jì) 2 方法 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 17 從 80℃ 保存的 muBL21 菌液中挑取少量接入 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng) 基因組提取 所用試劑盒為 TIANamp Bacteria DNA Kit，具體操作如下： 15ml， 10000rpm（ ~11， 500Xg）離心 1min，盡量吸凈上清。 200ul緩沖液 GA，震蕩至菌體徹底懸浮。 20ul Proteinase K 溶液，混勻。 220ul緩沖液 GB，震蕩 15sec， 70℃ 放置 10min，溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。 220ul無水乙醇，充分震蕩混勻 15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。 CB3 中（吸附柱放入收集管中）， 120xxrpm（ ~13， 400Xg）離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 CB3 中加入 500ul 緩沖液 GD， 12， 000rpm（ ~13， 400Xg）離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中。 CB3 中加入 600ul 漂洗液 PW， 120xxrpm（ ~13， 400Xg）離心 30sec，倒掉廢液，吸附柱 CB3 放入收集管中。 8. CB3 放回收集管中， 12， 000rpm（ ~13， 400Xg）離心 2min，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 置于溫室放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50ul 去離子水。 參見第二章 . 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 18 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 tanB、 talB、 gabT、 aroF編碼區(qū)序列的擴(kuò)增反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。 反應(yīng)體系： Takara primer star HS（ roloA） Component 50ul 5*primer star buffer 10ul dNTP mixture ( each) 4ul primer1（ 10uM） 1ul (10pmol) primer2（ 10uM） 1ul（ 10pmol） muBL21 genomic 1ul primer star ploymecase ddH2O 33ul 反應(yīng)條件： 34 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 2min 12℃ 保存 forever 、 lplA、 tyrA編碼區(qū)序列的擴(kuò)增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Takara primer star HS（ roloA） Component 50ul 5*primer star buffer 10ul dNTP mixture ( each) 4ul primer1（ 10uM） 1ul (10pmol) primer2（ 10uM） 1ul（ 10pmol） muBL21 genomic 200ng primer star ploymecase ddH2O 33ul 98℃ 預(yù)變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 64℃ 退火 5s 72℃ 延伸 1： 30s 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 19 反應(yīng)條件： 98℃ 預(yù)變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 61℃ 退火 5s 72℃ 延伸 2： 30s 34 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 2min 12℃ 保存 forever DNA片段的回收與純化 參見第二章 。 T克隆的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 T克隆第一步加 A的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Taq 聚合酶反應(yīng)體系 25ul easy Taq mix DNA template(20ng/ul) 反應(yīng)條件： 94℃ 預(yù)變性 5min 72℃ 總延伸 20min T克隆第二步加 T的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Takara DNA ligation Kit （ mighty Mix=takara code ） Tvector PMD19 1ul PCR product 1ul dH2O 3ul Mighty MIx 5ul 反應(yīng)條件： 16℃ 連接 forever 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 20 化學(xué)轉(zhuǎn)化 在 DH5α細(xì)胞中加入 3ul PMD19 質(zhì)粒，方法參見第二章 。將活化后的細(xì)胞涂布至 amp 抗性的 LB 平板上過夜培養(yǎng)。 T—clone vector的菌落驗(yàn)證 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Taq聚合酶反應(yīng)體系 10ul體系 Taq 聚合酶 dNTP 10*reactionbuffer 1ul DNAtemplate 200ng 反應(yīng)條件： 94℃ 預(yù)變性 DNA 5min 98℃ 變性 30s 61℃ 退火 30s 72℃ 延伸 2： 30s 34 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 2min 4℃ 保存 forever 3 結(jié)論與分析 muBL21基因組 DNAtyrA、 tnaB、 talB、 gabD、 gabT基因的驗(yàn)證 由于將基因組進(jìn)行 T 克隆的效率有限，而且 PMD19 的空質(zhì)粒在 amp 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 21 圖 31 T克隆驗(yàn)證膠圖 1： lplA 2： talB 3： 1 kb plus marker 4： gabD 5： tyrA 6： gabT 7： aroF 8： tnaB 抗性的 LB 平板上仍然可以生長，所以本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行基因測序之前，進(jìn)行了 pcr驗(yàn)證，電泳。圖 31 基因測序，各基因序列完全正確后，進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。 4討論 圖 41 同源重組示意圖 線性片段是最終同源重組的關(guān)鍵，當(dāng)染色體基因被 cas9 基因所切割后，先行片段上的同源臂將與重組菌染色體上的基因進(jìn)行結(jié)合，然后我們想要改變的基因?qū)?huì)被線性片段所替換。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 22 第四章 基因同源重組 1材料 菌體和質(zhì)粒 表 11 菌株和質(zhì)粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來源或文獻(xiàn) Source of reference Strains： E． coil DH5α WtBL21 Plamids： PtargetaroF PtargetlplA PtargetgabD PtargetgabT PtargettalB PtargettnaB PtargettyrA Cloning of bacteria 博邁特 Biomed This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab This lab 1． LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 23 1TAE 溶液 50TAE 20ml 定溶至 1000ml 50TAE 溶液 Tris 242g EDTA 冰醋酸 定溶至 1000ml 驗(yàn)證引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_test PF_gabD_test PF_gabT_test PF_talB_test PF_tnaB_test PF_tyrA_test PF_lplA_test PR_lplA_test PR_aroF_test PR_gabD_test PR_gabT_test PR_tnaB_test PR_tyrA_test PR_talB_test CAGATTGCTGACTCGCGTAAAAGC CCCTTTCCAGCCGACAGTGG GGTGAAGCCATCGACGTCACC GTCCTGCACATACAGGCGGTTG CTGCATCCGAAGGTGGTGGCC GCCAGCAATCCGTCTTTCAACTTCTG GGCATTACGTCGGTACGTTCCC CATCCATGCCGATAACTCCCGTAG GCAACGATCGTATTCTGATCAAACTGGC CGCCAGCTCTTTCAGCAGTGCC TCTGCGCGACGCCACCAGCTC CTCGCGGAATATTCCCCATGGTGC GACCCTCTCGGGTTATCAGGTG GTAGCCCCAGCACCGGACC 24 20 21 22 21 26 22 24 28 22 21 24 22 19 67 66． 8 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計(jì) 電轉(zhuǎn)儀 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第四章 基因同源重組 24 2 方法 wtBL21感受態(tài)的制備 準(zhǔn)備工作：滅菌 ddH2O 或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 15%甘油預(yù)先置于冰上至少 2hr； 預(yù)冷離心機(jī)。 (1)挑取 wtBl21 菌加入到 5ml無抗 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)； (2) 取過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)基 200ul 加入到 10ml LB 培養(yǎng)基， 37℃ ， 200rpm 培養(yǎng)23hr，至 OD600～ ； (3) 制備感受態(tài) : I 在高速冷凍離心機(jī) 4176。C 條件下 6000rpm離心 5min； II 用 mL 無菌預(yù)冷過的水洗滌重懸， 4176。C 條件下 6000rpm離心 5min，倒去上清夜。重復(fù) 3 次； III 用 120 181。L 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 15%甘油溶液溶解，并置于 80℃ 超低溫冰箱凍存。 cas9質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 (1) 取 2181。L cas9 質(zhì)粒加入步驟 1 中的一管感受態(tài)中，小心混勻后將菌體全部轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中； (2) 1800V 電轉(zhuǎn)； (3) 立即向電轉(zhuǎn)杯中加入 1mL LB，之后全部轉(zhuǎn)入 EP管中