【正文】 ......................................................................................... 29 第五章 回補基因?qū)w生長和色氨酸生產(chǎn)的影響 .............................................................. 30 1 材料 ........................................................................................................................ 30 菌種和質(zhì)粒 ..................................................................................................... 30 2 方法 ........................................................................................................................ 30 RBS8 質(zhì)粒的擴增 ........................................................................................... 30 mutB8/mutRBS8 中 mutRBS8 質(zhì)粒的剔除 ..................................................... 31 BL2 mutB wtB holoB8 感受態(tài)的制備 ............................................. 31 RBS8 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 ........................................................................................ 31 校正曲線制作 ................................................................................................. 31 wtBL holoBL8 和 BL21 生長曲線的對比 ................................................... 31 色氨酸含量的測定 ......................................................................................... 32 3 結(jié)果分析 ................................................................................................................. 32 4 討論 ......................................................................................................................... 35 參考文獻 ........................................................................................................................... 36 致謝 .................................................................................................................................. 37 i 摘要 誘變育種是工業(yè)上獲得性能優(yōu)良的菌株的必要手段，但是在對表達載體進行生物誘變時，就會不可避免的造成工程菌本身染色體的變異，為研究這些染色體的變異對工程菌本身的影響，本實驗使用同源重組技術(shù)對通過 artp誘導(dǎo)突變的 BL8（ BL21表達菌敲出 3個基因后的工程菌）工程菌進行基因替換 ,并以色氨酸定位研究對象，觀察其產(chǎn)率上變化，對其突變堿基對色氨酸的產(chǎn)量的影響進行了初步研究。最終發(fā)現(xiàn)重組菌與突變菌 B8以及 BL21的生長曲線并沒有比較明顯的差異，而最后 lplA， talB色氨酸產(chǎn)量高于野生型 B8菌低于突變型 B8菌，表明 lplA與 talB的突變堿基對色氨酸的合成有促進作用。這種方法簡單易行，但獲得優(yōu)良菌種的幾率小，一般難以滿足生產(chǎn)的需要。誘變育種操作簡便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產(chǎn)量，改進質(zhì)量，還可擴大產(chǎn)品品種和簡化工藝條件。具體的操作方法包括同源重組與雜交等。經(jīng)過生物技術(shù)演變，同源重組成為了將外源基因與受體染色體 NDA 上的同源序列之間發(fā)生互換，從而改變受體基因的特定序列，并最終改變基因的遺傳特性的方法 ［ 1］ 。原來雙螺旋結(jié)構(gòu)中的 一個互補鏈拋充了另外的配對鏈， RecA 蛋白脫落。在某些情況下， RecBCD 蛋白質(zhì)不僅把 DNA 鏈分開，而且將他們切開。絕大部分對小鼠 ES 細胞基因打靶的結(jié)果對于人基因結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要意義。這種重組技術(shù)是最近發(fā)展起來的一項可在染色體水平上進行遺傳操作的新技術(shù)，只需較短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位點，即可在生物體內(nèi)完成重組過程，省去了體外 DNA 酶切、連接等步驟。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進展 4 red同源重組的 篩選以及標記基因的剔除 雖然 Red 同源重組的效率很高，但是在同源重組過程中還是會有許多的菌落未重組成功，這就需要標記基因的介入，就是將需要重組的基因連接在一個標記基因上，將其一起同組到大腸桿菌的基因組。 （ 3）篩選與位點特異性重組的結(jié)合，把篩選標記基因的兩側(cè)加上 FLP 位點，F(xiàn)LP 位點具有特異性同組酶識別的作用。但是同源重組技術(shù)仍有很有的弊端需要改進，尤其是重組菌株的篩選與篩選基因的敲出，這個過程使得同源重組產(chǎn)生過程復(fù)雜、效率降低以及工作周期長等弊端。不過 ZFN 不是那么完美，它也有一些弊端，比如制備復(fù)雜，成本昂貴，最重要的是其專利被少數(shù)幾個商業(yè)公司所控制，這樣就會限制它在科研與生產(chǎn)方面的應(yīng)用。 TALEN 可以像 ZFN 那樣，對復(fù)雜懂得基因組進行修飾，另外他的構(gòu)建簡單，特異性強，受到了諸多科研工作者的喜愛。 CRISPR 序列是由日本科學(xué)家在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的 ［ 4］ ,但是這段序列的功能無法被當時的科學(xué)界確定，因此它一直 沒有受到有關(guān)科研人員的重視， 1995 年，西班牙的科學(xué)家們在地中海極嗜鹽菌和沃爾卡尼極嗜鹽菌的研究中第二次發(fā)現(xiàn)這個結(jié)構(gòu)，之后，此結(jié)構(gòu)也被陸續(xù)報道，但是直到多種細菌的基因組測序完成之后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)在細菌和古生菌中存在非常的廣泛。因此，科學(xué)家們推測 CRISPR 與抗外來基因入侵的自主免疫作用有關(guān)。該過程分為 3 個階段：適應(yīng)、表達和干擾。另外，科學(xué)家 研究發(fā)現(xiàn)， CRISPR 位點中間區(qū)的個數(shù)越多對噬菌體的抵抗力就越強。 核酸回收試劑盒 QLAEX Ⅱ 購自 Qiagen。并盡量去除多余的凝膠。 13,000g離心 1 分鐘，棄廢液。 （ 4） 13,000g離心 3 min，以去除柱中殘余乙醇。 （ 8） 用移液槍將細胞懸浮后，將細胞懸液加入到含有 spe 抗性的 LB 平板，涂布。 （ 3）加入 250ul buffer P2，溫和顛倒混勻 6~8 次，直到溶液變得清亮粘稠。 （ 7）重復(fù)步驟 6 操作一次 （ 8）溫室 12， 000rpm離心 2min，甩干殘留液體。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗證 15 第三章 基因組片段的獲取與驗證 1 材料 菌株和質(zhì)粒 1 表 31 菌株和質(zhì)粒 2 Table 31 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來源或文獻 Source of reference Strains： E． coil DH5α MuBL21 Plamids： pGEMT vecter Cloning of bacteria MutyrA mutnaB mutalB mugabT mugabD mulplA mu aroF Cloning vector 博邁特 Biomed This lab promega 引物 根據(jù) muBL21 genome 序列，利用 serial cloner 分析軟件設(shè)計合成以下引物： 引物 序列 長度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_up PF_gabD_up PF_gabT_up PF_talB_up PF_tnaB_up ATGCAAAAAGACGCGCTGAATAACGTACA ATGAAACTTAACGACAGTAACTTATTCCGC ATGAACAGCAATAAAGAGTTAATGCAGCG ATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCG ATGACTGATCAAGCTGAAAAAAAGCACTCT 29 30 29 26 30 67 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗證 16 PF_tyrA_up PF_lplA_up PR_lplA_down PR_aroF_down PR_gabD_down PR_gabT_down PR_tnaB_down PR_tyrA_down PR_talB_down ATGGTTGCTGAATTGACCGCATTACG ATGTCCACATTACGCCTGCTCATCT TTACCTTACCGCCCCCGCCATC TTAAGCCACGCGAGCCGTCAGC TTAAAGACCGATGCACATATATTTGATTTCTAAGTAA CTACTGCTTCGCCTCAGCAAAACACT TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTT TTACTGGCGGTTGTCATTCGCCTGA TTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC 26 25 22 22 37 26 33 25 28 66． 8 大腸桿菌培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 儀器 C1000 PCR 儀 超微量分光光度計 2 方法 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗證 17 從 80℃ 保存的 muBL21 菌液中挑取少量接入 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng) 基因組提取 所用試劑盒為 TIANamp Bacteria DNA Kit，具體操作如下： 15ml， 10000rpm（ ~11， 500Xg）離心 1min，盡量吸凈上清。 220ul無水乙醇，充分震蕩混勻 15sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。 8. CB3 放回收集管中， 12， 000rpm（ ~13， 400Xg）離心 2min，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 置于溫室放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 T克隆的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 T克隆第一步加 A的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Taq 聚合酶反應(yīng)體系 25ul easy Taq mix DNA template(20ng/ul) 反應(yīng)條件： 94℃ 預(yù)變性 5min 72℃ 總延伸 20min T克隆第二步加 T的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Takara DNA ligation Kit （ mighty Mix=takara code ） Tvector PMD19 1ul PCR product 1ul dH2O