基因表達(dá)和基因重組(文件)
【正文】 組 DNA的集合 * 從基因組 DNA文庫(kù)獲取目的基因 cDNA文庫(kù) 以 mRNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與 mRNA互補(bǔ)的 DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈 cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得 cDNA文庫(kù)。 2. 平端連接 適用于： 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15186。 3180。 3180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。 3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。 人工接頭及其應(yīng)用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5180。 （三）基因診斷 基本過(guò)程 區(qū)分或鑒定 DNA的異常 分離、擴(kuò)增待測(cè)的 DNA片斷 標(biāo)準(zhǔn) . 能正確擴(kuò)增靶基因； . 能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別； . 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。 目 錄 演講完畢，謝謝觀看！ 。 （四）基因治療 定義 基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) 導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌 （五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等 (插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇 α互補(bǔ) α 互補(bǔ)的檢測(cè) 原位雜交 Southern印跡 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出 重組 DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 小 結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開(kāi)環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 表達(dá)體系的建立 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達(dá) 1. 原核表達(dá)體系 （ ） 標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) 不宜表達(dá)真核基因組 DNA 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì) 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白 大鼠胰島素原 cDNA 的表達(dá)和分泌 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) 轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲(chóng)、乳類動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)載體 pFASTBACI 的物理圖譜 （一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾
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