【正文】 formation)。 命名 Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 同功異源酶 來源不同的限制酶 ， 但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn) ， 這些酶稱 同功異源酶 。 DNA文庫(kù) (genomic DNA library) 3. cDNA文庫(kù) (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) （見第 22章） * 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫(kù) 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 * 從基因組 DNA文庫(kù)獲取目的基因 cDNA文庫(kù) 以 mRNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與 mRNA互補(bǔ)的 DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈 cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得 cDNA文庫(kù)。 3180。 人工接頭及其應(yīng)用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5180。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) 導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌 （五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等 (插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇 α互補(bǔ) α 互補(bǔ)的檢測(cè) 原位雜交 Southern印跡 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出 重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 表達(dá)體系的建立 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達(dá) 1. 原核表達(dá)體系 （ ） 標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) 不宜表達(dá)真核基因組 DNA 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì) 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白 大鼠胰島素原 cDNA 的表達(dá)和分泌 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA