【正文】 分離和純化），然后進(jìn)行純培養(yǎng)和測(cè)定（見(jiàn)微生物測(cè)定法），擇優(yōu)選取微生物的菌種。 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第一章同源 重組技術(shù)的研究進(jìn)展 2 （ 2） 標(biāo)號(hào)重復(fù)基因重組育種 基因重組育種就是把不同的兩個(gè)或兩個(gè)以上的生物遺傳信息一起至于一個(gè)宿主細(xì)胞中，創(chuàng)建具有目的生物特性的重組柱。他們發(fā)現(xiàn)RecA 蛋白質(zhì)有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)，分別與單鏈擠雙鏈 DNA 結(jié)合，在試管里能從某些小病毒里提取的單鏈 DNA 結(jié)合，這樣以來(lái)，包裹著蛋白質(zhì)的 DNA 就會(huì) “侵犯 ”完整的雙螺旋 DNA，把它的互補(bǔ)鏈分開(kāi)，這個(gè)包裹蛋白質(zhì)的鏈不斷的試探著雙螺旋結(jié)構(gòu)，直到找到與它同源互補(bǔ)的序列，他就會(huì)插入到 DNA 的雙鏈中，形成一個(gè)三鏈結(jié)構(gòu)，如果有足夠長(zhǎng)的同源重組的序列， RecA 就會(huì)被激活為一個(gè)交換型結(jié)構(gòu)，催化鏈交換反應(yīng)，最終形成一個(gè)新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。例如，如果我們推測(cè)在弄得發(fā)育過(guò)程中包括有某一特殊基因的作用，這樣我們通過(guò)基因打靶將正?；?“knock out”，而代之以錯(cuò)誤的基因，這樣導(dǎo)致正?；虻耐耆Щ?，如果具有這中基因結(jié)構(gòu)的新生鼠有畸形的 小腦，則我們可以確定這個(gè)基因是小腦發(fā)育正常所必需的基因。實(shí)驗(yàn)證明，這種基因打靶技術(shù)是基因功能研究和新菌株構(gòu)建的有力工具。 CRISPR介導(dǎo)基因的編輯技術(shù) CRISPR介導(dǎo)基因的編輯技術(shù)的研究進(jìn)展 基因打靶，尤其是同源重組技術(shù)出現(xiàn)之后，無(wú)論是在科學(xué)研究，還是在工業(yè)生產(chǎn)上都有了革命性的變革。 20xx 年， TALEN 蛋白在成功應(yīng)用于酵母之中。 20xx 年，有 3 個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了 CRISPR 序列中的間隔序列與宿主菌的染色體外遺傳物質(zhì)的高度的相似。每次插入都伴隨這重復(fù)序列的復(fù)制，這樣就可以保證 CRISPR 中存在次噬菌體的序列信息，為適應(yīng)性免疫做基礎(chǔ)。 電泳時(shí)間足夠后，在紫外燈下小心吧所需的 DNA 片段切下來(lái)。 （ 3）重復(fù)步驟 2。 ptarget質(zhì)粒提取 (1)取 5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，室溫 12， 000rpm離心 1min，盡量將上清去除干凈 （ 2）加入 250ulBufferP1 用槍頭充分吹打是菌體重懸均勻。見(jiàn)圖 11，圖 12 N20測(cè)序?qū)Ρ? （ 1）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 aroF 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 256 TTTCAGATATTATCGCCGGG 275 Seq_2 20 TTTCAGATATTATCGCCGGG 1 （ 2）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 tyrA 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 255 TCGTGCGCCGCCAGCATGGC 274 Seq_2 20 TCGTGCGCCGCCAGCATGGC 1 （ 3）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 talB 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 257 ACACTGCTGAAAGAGCTGGC 276 Seq_2 20 ACACTGCTGAAAGAGCTGGC 1 （ 4）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 tnaB 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 255 GCGTATTGTGGATAAGTTCG 274 Seq_2 20 GCGTATTGTGGATAAGTTCG 1 （ 5）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 gabT 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 256 GGCGGTGAGTTTTGCGTCCG 275 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 14 Seq_2 20 GGCGGTGAGTTTTGCGTCCG 1 （ 6）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 gabD 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 254 TCAACAAATTGAACCAGTTG 273 Seq_2 20 TCAACAAATTGAACCAGTTG 1 （ 7）構(gòu)建到質(zhì)粒上的 gabD2 序列與野生型質(zhì)粒對(duì)比結(jié)果 Seq_1 256 CTTTACCGCCGCAAACCACA 275 Seq_2 20 CTTTACCGCCGCAAACCACA 1 4討論 在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們需要 Ptarget 質(zhì)粒指導(dǎo) cas9 質(zhì)粒將重組菌染色體的特定位點(diǎn)進(jìn)行切斷，所以就要求 Ptarget 質(zhì)粒工程菌的特定片段具有識(shí)別功能，根據(jù)CRISPR的原理，我們需要在 Ptarget質(zhì)粒上設(shè)計(jì)一個(gè) 20bp的基因序列，這樣 ptarget質(zhì)粒就會(huì)在重組菌的染色體上尋找能夠和這 20bp 序列互補(bǔ)的片段，然后將其切割。 CB3 中加入 600ul 漂洗液 PW， 120xxrpm（ ~13， 400Xg）離心 30sec，倒掉廢液，吸附柱 CB3 放入收集管中。圖 31 基因測(cè)序，各基因序列完全正確后，進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。 cas9質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 (1) 取 2181。C 條件下 6000rpm離心 5min； II 用 mL 無(wú)菌預(yù)冷過(guò)的水洗滌重懸， 4176。 反應(yīng)體系： Takara primer star HS（ roloA） Component 50ul 5*primer star buffer 10ul dNTP mixture ( each) 4ul primer1（ 10uM） 1ul (10pmol) primer2（ 10uM） 1ul（ 10pmol） muBL21 genomic 1ul primer star ploymecase ddH2O 33ul 反應(yīng)條件： 34 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 2min 12℃ 保存 forever 、 lplA、 tyrA編碼區(qū)序列的擴(kuò)增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 反應(yīng)體系： Takara primer star HS（ roloA） Component 50ul 5*primer star buffer 10ul dNTP mixture ( each) 4ul primer1（ 10uM） 1ul (10pmol) primer2（ 10uM） 1ul（ 10pmol） muBL21 genomic 200ng primer star ploymecase ddH2O 33ul 98℃ 預(yù)變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 64℃ 退火 5s 72℃ 延伸 1： 30s 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第三章 基因組片段的獲取與驗(yàn)證 19 反應(yīng)條件： 98℃ 預(yù)變性 DNA 30s 98℃ 變性 10s 61℃ 退火 5s 72℃ 延伸 2： 30s 34 個(gè)循環(huán)后 72℃ 補(bǔ)充延伸 2min 12℃ 保存 forever DNA片段的回收與純化 參見(jiàn)第二章 。 220ul緩沖液 GB，震蕩 15sec， 70℃ 放置 10min，溶液變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。 （ 6）加入 500ul的 Buffer PW，溫室 12， 000 離心 1min，棄收集管中廢液。 （ 6） 將從活化的 DH5α菌液放入離心機(jī)中離心 6000rpm， 5min （ 7） 棄去部分上清，使得 EP 管內(nèi)只留下 100ul上清液。 （ 2）將上述混合液加入 DNA 回收柱內(nèi)，如果溶液體積 700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液；室溫放置 12min或更長(zhǎng)時(shí)間。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 8 第二章 質(zhì)粒 ptarget的構(gòu)建 1 材料 表 11 菌株和質(zhì)粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和質(zhì)粒 Strains and plamids 基因型或表現(xiàn)型 Genotype or phenotype 來(lái)源或文獻(xiàn) Source of reference Strains： E． coil DH5α Plamids： PtargetlacZ Cloning of bacteria 博邁特 Biomed This lab 1． LB 培養(yǎng)基： 1000ml （高壓滅菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g TE（ ）： 10mmol/L trisHCL () 1mmol/L EDTA () 1XTAE： 40mmol/L trisCH3COOH 1 mmol/L EDTA Gel safe 溶膠液 1000ml 100ul gel safe 定溶至 1000ml 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第二章 質(zhì)粒 ptarget 的構(gòu)建 9 、試劑和試劑盒 生化與分子生物學(xué)試劑購(gòu)自原平浩試劑公司、上海生工生物公司、鼎國(guó)生物公司： taq 酶及 PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自 TAKARA 公司，化學(xué)試劑為分析純， PCR 引物由中美泰合合成。它可以針對(duì)噬箘體感染、質(zhì)粒接合所造成的基因侵入而形成的特異性的防御。其具有制備簡(jiǎn)單、成本低、作用高效等特點(diǎn)。它應(yīng)用于黑長(zhǎng)尾猴、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、煙草、人類(lèi) ips 細(xì)胞甚至 HIV 的藥物生產(chǎn)。 （ 2）篩選和反向篩選的結(jié)合使用，在第一步同源重組過(guò)程將兩個(gè)標(biāo)記基因?qū)氲捷d體上，然后通過(guò)正向基因?qū)⑵浜Y選出來(lái)，然后進(jìn)行第二補(bǔ)同源重組，用反向標(biāo)記基因篩選出重組成功的基因。 ［ 2］ PCR引物由兩部分組成，靠近 5c端的區(qū)域?yàn)榕c把基因同源的序列（約 40bp），靠近 3c 端的區(qū)域（約 20bp） 與模版 DNA 互補(bǔ)。但是它的聚合速度比分離速度要慢，所以最終將會(huì)在 DNA 的兩側(cè)各形成一個(gè)不斷增大單鏈 DNA 的環(huán)。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或 Holliday結(jié)構(gòu)（ Holliday Juncture Structure) 的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前 聯(lián)會(huì) 體階段、 聯(lián)會(huì) 體形成和 Holliday 結(jié)構(gòu)的拆分。化學(xué)誘變因素分為 3 種： ① 誘變劑與一個(gè)或多個(gè)核酸堿基發(fā)生化學(xué)變化，使 DNA 復(fù)制時(shí)堿基置換而引起變異，如羥胺亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等； ② 誘變劑是天然堿基的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，在復(fù)制時(shí)參入 DNA 分子中引起變異，如 5溴尿嘧啶、 5氨基尿嘧啶、 8氮鳥(niǎo)嘌呤和 2氨基嘌呤等； ③ 誘變劑在 DNA 分子上減少或增加 1～ 2 個(gè)堿基，使堿基突變點(diǎn)以下全部遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致碼組移動(dòng)突變體的出現(xiàn)，如吖啶類(lèi)物質(zhì)和一些氮芥衍生物（ ICR）等。得到重組后的 BL21野生菌后，首先進(jìn)行了重組菌與突變菌生長(zhǎng)曲線的對(duì)比，而后又進(jìn)行了色氨酸產(chǎn)量的定量分析。最終發(fā)現(xiàn)重組菌與突變菌 B8以及 BL21的生長(zhǎng)曲線并沒(méi)有比較明顯的差異，而最后 lplA， talB色氨酸產(chǎn)量高于野生型 B8菌低于突變型 B8菌，表明 lplA與 talB的突變堿基對(duì)色氨酸的合成有促進(jìn)作用。誘變育種操作簡(jiǎn)便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產(chǎn)量，改進(jìn)質(zhì)量，還可擴(kuò)大產(chǎn)品品種和簡(jiǎn)化工藝條件。經(jīng)過(guò)生物技術(shù)演變，同源重組成為了將外源基因與受體染色體 NDA 上的同源序列之間發(fā)生互換，從而改變受體基因的特定序列，并最終改變基因的遺傳特性的方法 ［ 1］ 。在某些情況下， RecBCD 蛋白質(zhì)不僅把 DNA 鏈分開(kāi)，而且將他們切開(kāi)。這種重組技術(shù)是最近發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)可在染色體水平上進(jìn)行遺傳操作的新技術(shù)，只需較短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位點(diǎn)，即可在生物體內(nèi)完成重組過(guò)程，省去了體外 DNA 酶切、連接等步驟。 （ 3）篩選與位點(diǎn)特異性重組的結(jié)合，把篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)加上 FLP 位點(diǎn)，F(xiàn)LP 位點(diǎn)具有特異性同組酶識(shí)別的作用。不過(guò) ZFN 不是那么完美，它也有一些弊端，比如制備復(fù)雜，成本昂貴，最重要的是其專(zhuān)利被少數(shù)幾個(gè)商業(yè)公司所控制，這樣就會(huì)限制它在科研與生產(chǎn)方面的應(yīng)用。 CRISPR 序列是由日本科學(xué)家在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的 ［ 4］ ,但是這段序列的功能無(wú)法被當(dāng)時(shí)的科學(xué)界確定，因此它一直 沒(méi)有受到有關(guān)科研人員的重視， 199