畢業(yè)論文-重組表達(dá)質(zhì)粒ppic9k-msbd-1的構(gòu)建(編輯修改稿)
2025-07-10 04:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 等表達(dá)載體 ： （ 1） 均利用 a 因子信號(hào)肽將目的肽分泌出胞外，但常出現(xiàn)因信號(hào) 肽酶切割效率低而導(dǎo)致目的肽氨 基端多出數(shù)個(gè)氨基酸； （ 2） 重組子表型同外源基因整合的拷貝數(shù)和高表達(dá) 特性尚不一定對(duì)應(yīng)，有待建立更好的挑選高效表達(dá)陽性重組子的方案； （ 3） 防御素在表達(dá)和純化過程中易被降解； （ 4） 如何避 免目的肽在表達(dá)過程中不進(jìn)行可能會(huì)影響其結(jié)構(gòu)與活性的無關(guān)修飾等。 蒙古綿羊 β防御素亞克隆到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體4 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1 的構(gòu)建 中，為了純化 方便，我們在 β防御素基因的 3′ 端加了六個(gè) HIS 標(biāo)簽。由于 β防御素的成熟肽 是由較少的氨基酸（ 38 個(gè)） 殘基組成的多肽，而在其 N 末端加入六個(gè) HIS 則可能會(huì)影響到 β防御的生物學(xué)活性。因此我們同時(shí)表達(dá)的兩各 β防御素（ β防御素的成熟肽，在 其后加六個(gè) HIS 標(biāo)簽） 。 2 材料與方法 材料 （ 1） 菌株和質(zhì)粒 酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K 為 Invitrogen 公司產(chǎn)品 ； pMD19T simple 載體購自大連寶生物公司； 基因工程菌 DH5α 為本實(shí)驗(yàn)是保存。 （ 2） 工具酶和生化試劑 限制性內(nèi)切酶 QuickCut? EcoR I、 Not I、 T4 DNA 連接酶 、 Taq DNA 聚合酶及氨芐青霉素購自大連寶生物公司； 瓊脂糖凝膠 DNA 回收 試劑盒 、 質(zhì)粒 小量 提 取試劑盒購自 天根 公司 ； DNA Marker DL2021（分子量為 202 1000、 750、 500、 250、100）； 50bp DNA Marker（ 分子量為 50、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、500、 550、 600、 700、 800、 900、 1000 、 1500） ； 溴化乙錠（ EB） 、 溴酚 藍(lán)購自Sigma 公司； Tryptone、 Yeast Extract 為 Oxoid 公司產(chǎn)品 。 （ 3） 儀器和試劑 Eppendorf 5417R 低溫高速離心機(jī)，德國生物公司生產(chǎn)； RTC100 PCR 儀，美國 MJ 生物公司生產(chǎn)； DYYⅢ 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)； Tanon Gis1000 凝膠成像分析系統(tǒng)，天能科技（上海）生物公司生產(chǎn)。 方法 綿羊 β防御素 1 成熟肽 （ mSBD1） 基因的克隆 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù) NCBI 報(bào)道的 綿羊 β防御素 1（ SBD1： u75250） 成熟肽序列 ， 設(shè)計(jì) mSBD1 真核表達(dá)產(chǎn)物的引物，并 在 mSBD1 成熟肽基因兩端加上合適的酶切位點(diǎn) EcoR I 和 Not I 及兩端的保護(hù)堿基， 設(shè)計(jì)引物 序列 （ 見表 1） 。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 5 表 1 引物序列 PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng) 體系：以表 1 序列為引物，實(shí)驗(yàn)室以構(gòu)建的 PUC57mSBD1T 為模板，表 2 為 PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR。 PCR 反 應(yīng)條件： 94 ℃ 預(yù)變性 5 min → 35 個(gè) PCR 循環(huán) ： 94 ℃ 變性 30 s，51 ℃退火 30 s， 72 ℃ 延伸 30 s。 終延伸 7 min。 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察。 表 2 PCR 反應(yīng)體系 （ 25 μL） 成分 Ingredients 加樣體積 ,Sample volume, ?L Premix Ex Taq 10 上游引物 下游引物 模板 DNA 1 滅菌 H2O 8 總體積 total 20 目的片段的回收和純化 目的片段的純化與回收按北京天根 DNA 回收試劑盒說明書進(jìn)行，具體步驟如下 ： （ 1） 將單一的目的 DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中在紫外燈下切下，放入干凈的離心管中加入 3 倍體積的溶膠液 PN， 50 ℃ 水浴放置 10 min，其間溫和的翻動(dòng)離心管，確保膠塊充分溶解； （ 2） 將膠塊溶解液加入一個(gè)吸附柱中，室溫靜置 2 min，然后 12,000 rpm 離心 1 引物 序列 Primer Sequence( 5′→3′) 5′ mSBD1 AGATTGTCCTGTCAC 3′ mSBD1 TCTACAACACTTAACTGGTGG 6 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9KmSBD1 的構(gòu)建 min，棄濾液； （ 3） 向吸附柱中加入 600 μL 漂洗液 PW， 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液； （ 4）重復(fù)步驟 （ 3） ； （ 5） 將吸附柱離心 12,000 rpm， 2 min，室溫放置數(shù)分鐘，徹底的晾干； （ 6） 將吸附柱安置于新的 mL 的離心管上，在 吸附柱膜的中央處加入 30 μL 的滅菌蒸餾水，室溫靜置 2 min； 12,000 rpm 離心 2 min，離心管中的溶液即為 DNA回收溶液。 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 （ 1） 目的片段與克隆載體的連接 使用大連寶 生物公司 pMD19T 載體試劑盒進(jìn)行目的片段與載體的連接反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒載體 pMD19T μL，目的 DNA 片段 μL，加入 5 μL 的Solution I，充分混勻， 16 ℃ 連接 過夜 ，并將連接產(chǎn)物命名為 pMD19TmSBD1。 （ 2） 重組克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 在 100 μL 感受態(tài)大腸桿菌 DH5α 中加 10 μL 連接產(chǎn)物 pMD19TmSBD1，混勻后冰浴 30 min， 42 ℃ 熱休克 90 s，再冰浴 2 min；加入 500 μL 無抗性 LB培養(yǎng)基 37 ℃ 搖菌 45 min；取 100 μL 轉(zhuǎn)化菌液涂布于含 Amp LB 培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng)過夜。 （ 3） 重組克隆質(zhì)粒的篩選及提取 挑取白色單菌落接種到 1 mL 含有 Amp 的 LB 培養(yǎng)基中， 37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 8 小時(shí)后，按 1:100 量接種于含 Amp 的 5 mL LB 培養(yǎng)基的試管中，37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，具體操作如下： ① 將 菌液轉(zhuǎn)入離心管， 12,000 rpm， 1 min，棄上清； ② 向留有沉淀的離心管中加 500 μL 溶液 P1 （ 含有 RNAaseA） ，振蕩懸浮菌體； ③ 向離心管中加入 500 μL 溶液 P2，溫和的顛倒混勻使菌體充分裂解，溶液變得清亮后，加入 700 μL 溶液 P3，混勻， 4 ℃， 12,000 rpm 離心 10 min，棄沉淀； ④ 將上清加入過濾柱 CS 中， 12,000 rpm 離心 2 min，將離心后收集管中的溶液加入吸附柱 CP4 中，再 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液； ⑤ 向吸附柱 CP4 中加入 500 μL 去蛋白液 PD， 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液； ⑥ 向 吸附柱 CP4 中加入 600 μL 漂洗液 PW， 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液 ， 再12,000 rpm離心 2 min； ⑦ 將吸附柱 CP4 12,000 rpm 離心 2 min，室溫干燥數(shù)分鐘； ⑧ 將吸附柱 CP 4 置于新的 mL 的離心管上，在吸附柱膜的中央處加入 100 μL 的滅菌蒸餾水，室溫靜置 2 min； 12,000 rpm 離心 1 min，離心管中的溶液即為質(zhì)
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