【文章內(nèi)容簡介】 。另一種策略是將變性蛋白分成幾份按一定的時間間隔逐步加入折疊緩沖液中，可以減少處理的體積、改善折疊的效率（35）。Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復(fù)性，產(chǎn)品的得率和比活比文獻(xiàn)報道的都要高（72）。在已經(jīng)發(fā)展的復(fù)性方法中，稀釋復(fù)性仍然是應(yīng)用最多的方法，但在放大時會因為處理體積太大造成成本太高。溶解復(fù)性獲得的蛋白質(zhì)，需要通過離心和過濾的方法去除不溶性的物質(zhì)，再按可溶性蛋白質(zhì)的處理方法進行下游的分離純化。擴張床吸附技術(shù)可以處理大量的樣品，而且分離的效能不受聚集蛋白質(zhì)的影響，F(xiàn)erre等將蛋白質(zhì)的稀釋折疊和擴張床吸附捕獲技術(shù)相偶聯(lián)，使用STREAMLINETM DEAE陰離子交換介質(zhì)，用于包涵體蛋白質(zhì)HAThβ2m的分離純化，可以得到48%回收率和94%純度的復(fù)性蛋白（23）。 色譜復(fù)性色譜方法不僅在蛋白質(zhì)的純化中得到廣泛應(yīng)用，也成為包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性的主要手段之一。色譜復(fù)性的方法的優(yōu)點是可以顯著的減少處理的時間，減少變復(fù)性過程中分子的聚集，使復(fù)性的同時也達(dá)到了純化的效果。第一類型的色譜復(fù)性就是凝膠過濾色譜復(fù)性，這一方法的原理在于通過分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)和小分子的變性劑分離，實現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的折疊。復(fù)性折疊中存在的一個問題就是蛋白質(zhì)的聚集，為了減少導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的分子間相互作用，可將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上，達(dá)到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質(zhì)的折疊，這一類型的復(fù)性為吸附型色譜復(fù)性，包括親和色譜復(fù)性，疏水相互作用色譜復(fù)性，離子交換色譜復(fù)性。對于一些稀釋法難于折疊的蛋白質(zhì)，這一方法具有更好的效果，如一些膜蛋白（24,50,71）。在折疊中，吸附的位點會影響到折疊，所以要優(yōu)化折疊的條件，才能得到好的折疊效果。另一種方法是在介質(zhì)上固定化伴侶分子或折疊酶，使層析柱成為一個折疊反應(yīng)器，固定化的優(yōu)點是能夠回收使用，不會引入新的雜蛋白。A. 凝膠過濾色譜復(fù)性凝膠過濾復(fù)性時，變性蛋白質(zhì)加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上，然后用折疊緩沖液進行洗脫，凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍，有助于聚集蛋白質(zhì)和正確折疊蛋白質(zhì)的分離。血小板衍生的生長因子（PDGF）由兩個亞基組成，M252。ller等用雙順反子表達(dá)載體同時表達(dá)等摩爾的A鏈和B鏈，但以包涵體的形式存在，為了得到活性的異源二聚體PDGFAB，包涵體用鹽酸胍變性后，先在變性條件下用凝膠過濾層析進行純化，使用稀釋復(fù)性，蛋白質(zhì)嚴(yán)重聚集，即使在10μg/ml蛋白質(zhì)濃度條件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝膠過濾復(fù)性，同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體，,最終異源二聚體得率可達(dá)75%（26）。在凝膠過濾復(fù)性中，發(fā)展了一種梯度復(fù)性的方法，這一方法的原理基于復(fù)性過程中，變性條件的快速改變加速了部分折疊蛋白質(zhì)的聚集，導(dǎo)致沉淀形成和非特異性的吸附，通過梯度洗脫逐步降低變性劑的濃度，使蛋白質(zhì)處于一個梯度改變的變性劑條件下，控制蛋白質(zhì)的折疊和聚集速度，使蛋白質(zhì)在離開層析柱時，處于折疊緩沖液中，從而改善活性蛋白的回收率。通常選擇線性的梯度用于折疊復(fù)性，對于不同的蛋白質(zhì)還有其它的模式，如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定，在此變性劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。這一復(fù)性過程中，梯度在上樣前就在層析柱中已經(jīng)形成，上樣后使用變性緩沖液進行洗脫，由于蛋白質(zhì)受到的分子排阻比變性劑大，蛋白質(zhì)移動的速度比變性劑梯度移動的速度快，最終蛋白質(zhì)通過整個變性劑區(qū)，離開層析柱時處于折疊緩沖液中。通過尿素線性梯度復(fù)性，變性溶菌酶以高蛋白濃度上樣（17mg/ml）可以獲得90%的活性回收率，與稀釋復(fù)性和非梯度凝膠過濾復(fù)性相比較，顯著的改善了活性回收率（27）。對單鏈Fv片段包涵體蛋白，使用梯度同時改變變性劑濃度和pH，比單改變變性劑濃度的梯度復(fù)性或不使用梯度的凝膠過濾復(fù)性具有更高的活性得率（28）。另外應(yīng)用連續(xù)環(huán)形色譜，蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉(zhuǎn)的色譜柱上，在提高折疊效率的同時，也提高了色譜復(fù)性處理的能力（29,30）。B. 吸附型色譜復(fù)性吸附型色譜復(fù)性是在變性條件下，利用變性蛋白質(zhì)可瞬間結(jié)合在特定層析介質(zhì)上的特性，進行緩沖液的交換，降低變性劑的濃度，可先改變變性劑濃度使吸附的蛋白質(zhì)逐漸的折疊復(fù)性，在柱中的變性劑溶液完全被置換成折疊緩沖液后，再通過在折疊緩沖液中加入鹽或其它添加劑進行原位純化洗脫，為了獲得好的折疊效率和純化效率，常采用梯度洗脫或階段洗脫的方法。由于蛋白質(zhì)結(jié)合在固相介質(zhì)上，減少了折疊過程中由于分子間相互作用所造成的聚集，所以這一方法可提高折疊的效率。在變性條件下，蛋白質(zhì)能否進行離子交換色譜復(fù)性和疏水色譜復(fù)性，與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)密切相關(guān)，僅有有限的報道（36），而給蛋白質(zhì)加上一個親和標(biāo)簽，表達(dá)得到的包涵體再用親和色譜復(fù)性對不同的蛋白質(zhì)有一定的通用性，應(yīng)用也更為廣泛，尤其是金屬螯合親和色譜復(fù)性。多肽通過在N端或C端加上一個親和標(biāo)簽，在包涵體的純化上有兩個方面的用途，其一是包涵體變性溶解后，利用親和色譜直接進行包涵體溶液的純化，再用稀釋或透析的方法進行復(fù)性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于親和色譜復(fù)性(61,66,67,69,70)。由于蛋白質(zhì)或肽類標(biāo)簽在變性條件大多失去了與親和介質(zhì)結(jié)合的特性，目前這一技術(shù)用的最多的是組氨酸標(biāo)簽。Zahn等在鎳親和層析柱（NiNTA argrose）上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進行帶有組氨酸標(biāo)簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊，抑制了蛋白質(zhì)聚集和分子間二硫鍵的形成，再用咪唑緩沖液對目標(biāo)蛋白進行洗脫，純化的流程圖如圖4所示(20)。Stempfer等在α葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸標(biāo)簽，研究了變性蛋白在肝素親和介質(zhì)上的折疊復(fù)性，通過優(yōu)化實驗條件，蛋白質(zhì)可以在5mg/ml濃度條件下高效復(fù)性(59)。圖4：利用金屬螯合色譜復(fù)性純化人朊病毒蛋白多肽片段的流程圖除了以上的應(yīng)用，更令人鼓舞的是這一技術(shù)已成功用于膜蛋白的復(fù)性（24,50,71）。酮戊二酸載體蛋白是線粒體內(nèi)膜上的一種轉(zhuǎn)運蛋白， C41（DE3）作為宿主菌使C端帶有組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白形成包涵體獲得大量表達(dá)，再用鎳柱親和色譜進行復(fù)性和純化，獲得的融合蛋白具有和天然蛋白一樣的轉(zhuǎn)運活性，每升的細(xì)菌培養(yǎng)液可獲得15mg的活性蛋白（50）。C. 由固定化伴侶分子和/或折疊酶介導(dǎo)的色譜復(fù)性分子伴侶和折疊酶在蛋白質(zhì)的正確折疊中起著重要的作用，是近年來的一個研究熱點，它們和蛋白質(zhì)在體內(nèi)共表達(dá)已經(jīng)成為促進蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的重要方法。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個方面的應(yīng)用，其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進包涵體蛋白質(zhì)的折疊和裝配（39），另一方面就是通過固定化的伴侶分子和/或折疊酶來介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。Altamirano等通過固定化伴侶分子GroEL的活性小片段、脯胺酰異構(gòu)酶和大腸桿菌氧化還原酶DsbA將蝎子毒素蛋白Cn5的折疊得率從5%提高到87%（18）。在單鏈抗體Fv段的透析復(fù)性中，加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率，得到的單鏈抗體Fv段和天然抗體Fv段具有相同的功能（46）。 其它的復(fù)性方法近年，還有一些其它的方法用于蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，如雙水相萃取復(fù)性（76,77,78,79），反向膠束復(fù)性（33,75,80），高靜力壓復(fù)性（31,81,82,83），這些方法對特定的蛋白質(zhì)可獲得高的復(fù)性效率，大多還停留在研究階段，相信隨著方法的成熟和普及，將會為包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性提供更多的選擇手段。重組蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)以后，首先必須從細(xì)菌釋放才能進行下游的分離純化過程。蛋白質(zhì)釋放的方法依賴于蛋白質(zhì)最終在細(xì)胞中的定位。大部分的可溶性重組蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而一些膜蛋白常常表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)膜上，還有一些則分泌到細(xì)菌的周質(zhì)間隙或細(xì)胞外。將重組蛋白分泌到周質(zhì)間隙或細(xì)胞外可避免破碎細(xì)胞和處理細(xì)胞碎片，而且雜蛋白的種類和量都要少得多（在周質(zhì)空間大約有100種不同蛋白質(zhì)，而在胞漿內(nèi)有大約4000種不同的蛋白）。對于分泌到周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì)，使用滲透壓沖擊，凍融法，溶菌酶處理方法可以使目標(biāo)蛋白釋放。對于表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)膜和胞內(nèi)的蛋白質(zhì)要經(jīng)過細(xì)胞破碎，常用的方法有高壓勻漿法、超聲破碎法、珠磨法、化學(xué)滲透法和酶溶解法，每種方法有自己的特點，現(xiàn)在的研究常常將幾種方法結(jié)合，并緊密結(jié)合下游固液分離過程（87）。對于表達(dá)于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，先要破碎細(xì)胞后分離細(xì)胞膜，再抽提溶液進行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水區(qū)域，在抽提溶液中需要加入表面活性劑，一方面破壞細(xì)胞膜，溶解膜結(jié)構(gòu)，另一方面促進膜蛋白的溶解和穩(wěn)定，常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。表面活性劑Triton X114的臨界溶液濃度（critical solution temperature）為23℃，在此溫度以下，形成均一的溶液，在此溫度以上，則形成富含表面活性劑的相和低濃度表面活性劑的相，通過溫度誘導(dǎo)的相分離可以使膜蛋白進入富含表面活性劑的相，實現(xiàn)表達(dá)膜蛋白的濃縮，是一種應(yīng)用廣泛的表面活性劑。在膜蛋白的整個分離純化過程中，都要使用表面活性劑來模擬脂質(zhì)的功能，但膠束與蛋白質(zhì)的相互作用常常降低層析的分辨率，而且聚集的情況更容易發(fā)生，所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑，以及使用多大的濃度，對分離純化的影響最為關(guān)鍵（88）。釋放出目標(biāo)蛋白后，再進行液相和固相細(xì)胞碎片的分離，得到澄清的蛋白質(zhì)溶液就可以進行下游的分離純化了，涉及膜分離技術(shù)、沉淀分離技術(shù)、萃取技術(shù)、層析技術(shù)、電泳分離技術(shù)，以及一些整合技術(shù)，如擴張床吸附，雙水相萃取。膜分離技術(shù)和沉淀分離技術(shù)是兩種傳統(tǒng)的技術(shù)，不管在實驗室研究，還是在工業(yè)的生產(chǎn)上都有應(yīng)用，近年來功能性膜的應(yīng)用和膜色譜的發(fā)展大大擴展了膜分離的應(yīng)用領(lǐng)域，而親和技術(shù)和沉淀分離相結(jié)合產(chǎn)生了親和沉淀技術(shù)，提高了分離的特異性。擴張床吸附和雙水相萃取整合了細(xì)胞碎片處理過程和初步濃縮純化過程，在大規(guī)模純化重組蛋白時具有很強的優(yōu)勢。重組蛋白和多肽的分離純化（3）網(wǎng)絡(luò) 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開始于60年代，現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。在層析技術(shù)的發(fā)展過程中，首先是基質(zhì)填料的發(fā)展。由于蛋白質(zhì)大分子具有高的親水性，要求分離介質(zhì)具有親水的界面，為活性大分子提供適宜的微環(huán)境，早期的離子交換介質(zhì)不具有親水的特性和大的孔結(jié)構(gòu)，僅用于小分子的分離純化，Peterson 和 Sober 等在離子交換介質(zhì)的研究上進行了開拓性的工作，選擇特定的纖維素作為離子交換基團的基質(zhì)，合成的離子交換纖維素介質(zhì)具有高的結(jié)合容量和低的不可逆性吸附，并得到實際應(yīng)用（89,90）。在過去的幾十年里各種層析用基質(zhì)得到發(fā)展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，這些基質(zhì)都有其的物理和化學(xué)特點，在蛋白質(zhì)的分離純化中發(fā)揮著重要的作用。層析技術(shù)的另一個發(fā)展方向是功能基團的發(fā)展，適應(yīng)不同的選擇性要求，如各種不同親和層析介質(zhì)的合成，使一步純化就能達(dá)到很高的純度。層析技術(shù)的第三個發(fā)展方向是操作模式的多樣化，已發(fā)展的操作模式有擴張床吸附、模擬移動床層析、置換層析、灌流層析和徑向?qū)游?，這幾種方法能夠具有處理大體積樣品的能力，適合于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。在重組蛋白的分離純化中，各種分離模式都得到應(yīng)用。凝膠過濾層析是基于液相的分離方法，凝膠包裹的內(nèi)環(huán)境形成固定相，凝膠的外環(huán)境形成流動相，蛋白質(zhì)分子越大越不容易滲透進入固定相，所以又稱為分子篩層析，層析的分辨率與介質(zhì)的排阻極限和上樣的體積有關(guān)，是一種易于操作的層析方法，另外凝膠過濾層析常用于緩沖液交換，此時可使用較大的載量。離子交換層析基于蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)電荷間的相互作用，高于蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，低于蛋白質(zhì)等電點蛋白質(zhì)帶正電荷，不同的蛋白質(zhì)在一定的pH條件下與介質(zhì)上的離子之間相互作用不同，而產(chǎn)生不同的選擇性，根據(jù)帶電基團的類型和強度可分為四種類型：強陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強陽離子交換層析、弱陽離子交換層析，通常采用一定的平衡條件使目標(biāo)蛋白選擇性的吸附在介質(zhì)上，也可以使雜蛋白吸附，而目標(biāo)蛋白選擇性的穿過。疏水層析基于蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)和介質(zhì)疏水配體間的相互作用，在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞作用釋放，裸露的疏水區(qū)與疏水配體相互作用而被吸附，隨著鹽濃度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白質(zhì)的水化層又形成，蛋白質(zhì)最終解吸附，其它物質(zhì)，如乙二醇、甘油、非離子表面活性劑也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、溫度和添加劑的影響。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結(jié)構(gòu)，有烷基配體和芳香基配體，烷基的鏈越長，蛋白質(zhì)的保留就越強。羥基磷灰石層析常用于抗體的分離純化，對其分離的機制還了解的不清楚，但涉及介質(zhì)上鈣離子和磷酸根與蛋白上帶電殘基的相互作用。傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學(xué)穩(wěn)定性比較差，僅能在低流速條件下使用，新的球形羥基磷灰石克服了以上缺點，對于其它方法不易分離的蛋白質(zhì)，可以用羥基磷灰石層析進行分離純化。等點聚焦層析是基于蛋白質(zhì)等電點不同的分離模式，以陰離子交換劑為固定相的情況為例，兩性電解質(zhì)緩沖液和離子交換基團相互作用形成pH梯度，蛋白質(zhì)在pH 大于其等電點時吸附，在pH低于其等電點時解吸附，由于蛋白質(zhì)區(qū)帶后部所處微環(huán)境的pH總是低于蛋白質(zhì)區(qū)帶前部所處微環(huán)境的pH，處于后部區(qū)帶的蛋白質(zhì)先于前部開始移動，從而產(chǎn)生聚焦效應(yīng)。親和層析基于蛋白質(zhì)和親和配體的特異性相互作用，是最為高效的分離純化方法，用于親和層析的配體可以是針對抗原的抗體、針對蛋白質(zhì)分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。利用DNA重組技術(shù)，進行目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)，再用親和層析進行分離純化，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)表達(dá)純化的常用手段。表 3 常用層析方法的分離特點和不同純化階段的適用性層析方法親和層析凝膠過濾層析離子交換層析疏水層析分離機制特異性親和大小電荷疏水性選擇性非常高中等高高→中等載量高低高高純化速度中等中等→低高高生物相容性好非常好好中等→好目標(biāo)蛋白的得率高高高中等→高捕獲濃縮階段++++++++++中間純化階段++++++++++精制純化階段+++++++++蛋白質(zhì)能否獲得高效分離純化既與層析介質(zhì)的理化性質(zhì)（如配基組成、配基密度、孔徑、表面積、顆粒大小、顆粒分散性）有關(guān)，又與流動相參