【文章內(nèi)容簡介】 （注意：務(wù)必不能用力擰緊，否則會(huì)降低其密封性）。把底座倒扣于腔體上，向上調(diào)整活塞桿的位置，直至腔內(nèi)空氣完全排出，流出一滴樣品為止，輕輕旋緊針形閥。（6）雙手托起整個(gè)高壓腔組件，翻轉(zhuǎn)至正向位置，將其置于升降臺(tái)上（事先要確保操作臺(tái)足夠的低，以容的下整個(gè)組件），向后推動(dòng)底座，使底座固定于三個(gè)位置校準(zhǔn)針之間，并調(diào)整腔體使針形閥朝向正面。將固定夾固定于支持桿上，擰緊固定夾上的兩個(gè)螺絲以固定腔體。將活塞桿上的手柄轉(zhuǎn)至與固定夾垂直的方向。（7）打開電源，將檔位手柄轉(zhuǎn)至HIGH檔，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥至50psi，升降臺(tái)開始上升，當(dāng)活塞桿接觸上頂臺(tái)后，繼續(xù)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥，直至壓力達(dá)到需要的壓力（大腸桿菌的破碎壓力一半設(shè)定為12000psi，芽孢桿菌設(shè)定為2000psi）。（7）取一冰預(yù)冷的離心管（或者將離心管至于冰中）置于樣品噴射管出口處，輕輕逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)針形閥，小心控制樣品的流出速度，根據(jù)破碎程度決定流速（建議在噴射管出口處接一個(gè)1cm長的透明的塑料管如輸液管，通過觀察塑料管流出樣品的透明度來判斷破碎是否完全）。當(dāng)活塞桿上的安全指示線（Stop Line）降至腔體上表面時(shí)，迅速關(guān)緊針形閥（不要過緊），旋轉(zhuǎn)檔位手柄至DOWN位置。待升降臺(tái)完全下降后，繼續(xù)降低壓力至零，關(guān)閉電源。（8）松開固定夾，取出高壓腔，重新倒置于三腳固定器上，取出底座。將各部分拆開，徹底清洗。底座及噴射管的內(nèi)壁要重點(diǎn)沖洗，涂有凡士林處要用洗潔精徹底洗凈?！咀⒁馐马?xiàng)】（1）儀器最大承受壓力為4000psi（指示針2500）。（2）各O形環(huán)處（包括樣高壓腔，底座，活塞桿和針形閥）一定要涂凡士林潤滑，以降低磨損，防止損傷。（3）壓力的升高或降低速度要控制在一定范圍內(nèi)。升高壓力前務(wù)必保證整個(gè)組件固定于升降臺(tái)上,任何的松動(dòng)可能導(dǎo)致事故。（4）活塞桿的手柄要與固定夾垂直，否則會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)。（5）嚴(yán)禁將出樣閥過分?jǐn)Q緊，否則會(huì)損壞內(nèi)部撞針，以不流出液體為準(zhǔn)。（6）嚴(yán)禁使活塞桿下至安全線以下，否則會(huì)導(dǎo)致活塞桿與底座損壞。（7）使用完畢要將壓力控制閥轉(zhuǎn)至壓力為零。（8）各部件清洗要徹底，否則底座小孔容易堵死，活塞桿上殘留的菌體會(huì)在未洗凈的凡士林上滋生。（9）長期不用應(yīng)保存在干燥的環(huán)境中，必要時(shí)可涂凡士林防止生銹。（10）壓力腔的空氣一定要完全排出，否則當(dāng)樣品完全排出時(shí)，造成活塞與壓力池底座直接接觸，造成損傷，由于壓力非常大，有可能導(dǎo)致活塞或壓力池底座變形，造成永久性損傷?。?1）在搬動(dòng)裝好的樣品池時(shí)，一定要雙手，一手扶住住高壓腔，一手托住底座，防止底座脫落而造成事故。（12）O型環(huán)若老化則及時(shí)更換。（13）操作過程中禁止將液體濺入機(jī)箱內(nèi)部。（14）儀器使用過程中出現(xiàn)故障應(yīng)及時(shí)與負(fù)責(zé)人聯(lián)系。 His Tag 純化操作實(shí)例本實(shí)驗(yàn)室中所用的表達(dá)載體pET28a（+）中含有一個(gè)編碼多聚組氨酸的序列，即HisTag，因此會(huì)獲得帶有HisTag的重組目標(biāo)蛋白。HisTag可與金屬Ni2+離子結(jié)合，從而有利于目標(biāo)蛋白的純化。加上了HisTag的蛋白在非變性的條件下可用Ni2+親和層析柱純化。純化蛋白的原理是：當(dāng)親和層析柱負(fù)載了Ni2+后，可以選擇性吸附暴露在蛋白表面具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基（特別是組氨酸殘基）。蛋白質(zhì)中含有的組氨酸越多，與Ni2+結(jié)合的特異性就越高，則將其洗脫下來會(huì)需要更高的咪唑濃度。含有組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白與細(xì)胞中的總蛋白相比，具有更高的Ni2+結(jié)合特異性。為了得到具有較高純度的目標(biāo)蛋白，必須找到一個(gè)合適咪唑濃度的洗脫液（結(jié)合緩沖液），在此濃度下非特異性的雜蛋白能從柱上洗脫下來，而與Ni2+特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白不會(huì)被洗脫。最后用更高咪唑濃度的緩沖液（洗脫緩沖液）將目標(biāo)蛋白洗脫下來，此時(shí)目標(biāo)蛋白特異性的存在于該咪唑濃度的洗脫液中，從而得到純化了的目標(biāo)蛋白質(zhì)。 重組蛋白的誘導(dǎo)（1）載體構(gòu)建：本實(shí)驗(yàn)采用pET28a（+）表達(dá)載體， DH5α， BL21(DE3)。具體操作參考基因克隆與轉(zhuǎn)化部分。（2）挑一個(gè)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中（含100μg/m卡那霉素和），于37℃過夜培養(yǎng)。（3）取1ml過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃～2小時(shí)至對數(shù)生長期。（4）在培養(yǎng)物中加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） mM，按照預(yù)先建立的最佳表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。（5）1200 rpm，離心2min，收集菌體。（6）棄上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸緩沖液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH ），充分懸浮洗滌菌體。（7）12000 rpm，離心2min，收集菌體。（8）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重懸菌體。（9）冰浴條件下超聲波處理3min，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為5～6，頻率為60～70％，處理時(shí)以不發(fā)生氣泡，不過熱為準(zhǔn)，以菌液變清晰為終止標(biāo)準(zhǔn)。（10）12000 rpm，4℃離心20min，將上清移到干凈滅過菌的50ml離心管。SDSPAGE 分析蛋白的表達(dá)情況。若目的蛋白分布在上清中，繼續(xù)進(jìn)行下面的純化操作。 目標(biāo)蛋白的體外純化（1）灌制好Ni2+NTA親和層析柱，用去離子水進(jìn)行緩慢洗脫，避免在柱床中引入氣泡。（2）用10倍柱床體積的starting buffer進(jìn)行預(yù)平衡，上樣，將細(xì)胞破碎后的上清液注入Ni2+NTA親和層析柱中。（3）用10倍ml的starting buffer進(jìn)行漂洗，收集濾過液。（4）開始用5倍柱床體積的含20 mM咪唑的starting buffer進(jìn)行洗脫，并對洗脫液進(jìn)行收集。（5）依次用5倍柱床體積的含40 mM，60 mM，80 mM，100 mM，200 mM，300 mM和500 mM咪唑的starting buffer進(jìn)行洗脫，分別對洗脫液進(jìn)行收集。（6）通過SDSPAGE檢測回收的效果，確定咪唑最合適洗脫濃度。（7）從每管收集的濾出液取出10μl的樣品，加入10μl的2X SDS凝膠加樣緩沖液，搖勻。（8）沸水浴處理3min。（9）取出樣品，將10μl樣品全部上樣于適當(dāng)濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。【注意事項(xiàng)】（1）樣品可貯存于4℃，以備在聚丙烯酰胺凝膠上加樣。（2）用考馬斯亮藍(lán)或銀染液進(jìn)行染色，檢測重組蛋白的純化程度，并找到咪唑最合適洗脫濃度，也就是純化蛋白含量最多的一管洗脫液所對應(yīng)的濃度；并將該純化出來的蛋白質(zhì)經(jīng)過PD10柱子以去掉溶液中的咪唑?！?（3）蛋白質(zhì)被洗脫完成之后，要及時(shí)地清洗柱子，使柱子能重復(fù)使用。（4）在下次對同一蛋白的純化過程中，即可根據(jù)膠圖所顯示的個(gè)洗脫液中蛋白濃度的情況來優(yōu)化整個(gè)洗脫過程。蛋白質(zhì)溶液的去鹽處理（使用PD10去鹽柱）（1）用10ml的starting buffer平衡PD10去鹽柱。（2）上樣：。（3）用10ml的starting buffer去洗PD10去鹽柱，開始收集濾出液，每1ml收集一管。離心管應(yīng)該先在冰上預(yù)冷。（4）電泳檢測重組蛋白質(zhì)的純化程度。（5）具體方法和過程與上面步驟一致。（6）選擇合適的純化蛋白樣品，加入1倍體積的預(yù)冷甘油。接著將蛋白質(zhì)樣品置于－80℃保存，以備使用。【注意】PD10去鹽柱可以多次反復(fù)使用，但是不能使柱子變干，保存時(shí)應(yīng)該用相應(yīng)的緩沖液浸泡，并且置于4℃。圖 1：PD10去鹽柱除去鹽離子示意圖（載自Amersham Biosciences產(chǎn)品說明） Histag NOTE（1）若His標(biāo)簽蛋白沒有結(jié)合，請依次檢查：可能原因1：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確。策略：檢測pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高?？赡茉?：組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露。策略：在變性條件下(用4～8 M 脲，或4～6 M鹽酸胍)進(jìn)行純化。可能原因3：HIS標(biāo)簽丟失。策略1：WB或者antihis的抗體檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變histag的位置(Cterminal or Nterminal)，必要時(shí)增加his個(gè)數(shù)(常用6～10個(gè))；策略2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。（2）