生化綠色熒光蛋白的基因克隆及表達(dá)開題報(bào)告(編輯修改稿)
2024-09-01 09:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 Not Ⅰ。 SIMf140 SANYO Eppendof離心機(jī) 電泳儀 電子天平 臺(tái)式離心機(jī) 控溫磁力攪拌器 調(diào)溫電熱套 pH計(jì) 冰箱 臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器 手提紫外燈 生物潔凈工作臺(tái) 瓊脂糖凝膠電泳電泳裝置 電熱恒溫水溫箱 凝膠成像分析系統(tǒng) 酒精燈 培養(yǎng)皿 移液槍 槍頭 接種環(huán) 酒精棉球 滅菌槍頭 Parafilm膜 離心管 IceMaker【實(shí)驗(yàn)方法】? 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ? DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備 ? 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 ? 堿法提質(zhì)粒 ? 酶切鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳 ? PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ? Pet28aGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21? 重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)表達(dá) 【具體實(shí)驗(yàn)步驟】1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28aGFP的構(gòu)建流程2. DH5α 和BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備1) 將0~4 ℃保存的DH5α 和BL21菌種分別接種在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃下250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)16 h 。2) 將分別接種過(guò)夜菌：LB按1:50的比例接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)2～3 h至OD=～ 。3) mL菌液轉(zhuǎn)入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min離心5 min。棄上清液， mol/L CaCl2緩和懸菌。冰上放置1530 min后，4 ℃下5000 r/min離心10 min。4) 棄上清液， mol/L CaCl2（含15%甘油）緩和懸菌，放在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。3. 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取制備好的感受態(tài)細(xì)胞100 μl，冰上解凍，均勻懸浮。2) 加入2 μl酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置1030 min。3) 42 ℃水浴中熱擊70 sec后，冰上放置2 min。4) 加入200 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，50100 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。5) 取200 μl懸浮細(xì)胞涂布在含合適抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置12 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培養(yǎng)倒置1216 h。4. 堿法提質(zhì)粒1）感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，平皿內(nèi)有但菌落長(zhǎng)出。2) 用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒(méi)于2 mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃, 180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3) ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 r/min 離心1分鐘，吸棄上清。4) 向離心管中加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重懸沉淀。5) 加入200 ml新配制的溶液 Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘。6) 加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液 Ⅲ，輕輕混勻，冰上放置3~5分鐘。7) 用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。8) 加等體積氯仿400 ml抽提，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9) 吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，于室溫放置2分鐘；用微量離心機(jī)于4 ℃
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