生化綠色熒光蛋白的基因克隆及表達開題報告-預覽頁
【正文】 His Tag／Thrombin／T7 tag結(jié)構(gòu)以及一個可以選擇的Cterminal HisTag。使用Notl酶，Bamhl酶，這是一對最合適的內(nèi)切酶。 類似于DNA的 天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR 技術(shù)是Kary Mullis 在1985 年建立起來的在細胞體外合成DNA 的一種方法?！緟⒖嘉墨I】[1] 梁國棟. 最新分子生物學實驗技術(shù)[ M] . 北京: 科學技術(shù)出版社, 2001, 174.[2] 賈艷華，李國勛，張杰 熒光蛋白及其應用[3] 魏春紅，李毅主編 聚合酶鏈反應PCR 現(xiàn)代分子生物學技術(shù) 高等教育出版社，:4546【研究方案】通過分別將DH5α (pEGFPN3)和DH5α(pET28a)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒pET28aGFP， DH5α感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化,通過限制性核酸內(nèi)切酶Not I與Bam H1和PCR對所建質(zhì)粒進行分析鑒定后, 通過轉(zhuǎn)化的方法把含綠色熒光蛋白（GFP）外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體BL21內(nèi)進行表達，再用IPTG誘導GFP基因表達，根據(jù)觀察是否可以看到顯現(xiàn)綠色，判斷GFP基因是否在大腸桿菌中成功表達。2) 將分別接種過夜菌：LB按1:50的比例接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)2～3 h至OD=～ 。4) 棄上清液， mol/L CaCl2（含15%甘油）緩和懸菌，放在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。4) 加入200 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，50100 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。3) ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4 ℃、11000 r/min 離心1分鐘，吸棄上清。7) 用微量離心機于4 ℃、11000 r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。向已干燥的離心管內(nèi)加20 ml超純水溶解質(zhì)粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 ℃處理1小時后于20 ℃貯存。2) 輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上。6) 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿12 cm處，停止電泳。變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 20個循環(huán)，72 ℃延伸 2 min。加入2 μl經(jīng)過酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET28aGFP，輕輕混勻，冰上靜置1030 min。4) 吸取200 μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置12 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培養(yǎng)倒置1216 h。4） 用紫外線照射菌體沉淀，保存照片。4. IPTG誘導表達分別在日光燈和紫外光下進行照射，如果攜帶重組質(zhì)粒pET28aGFP的大腸桿菌BL21用IPTG誘導表達后呈現(xiàn)綠色，說明含外源基因GFP的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21體內(nèi)成功表達；而沒有經(jīng)IPTG誘導的菌體則不發(fā)出綠色熒光。 （3）化合物及無機離子的影響：在鈣離子的基礎上，聯(lián)合其他二價金屬離子或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。一般情況下DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。 （8）菌液涂平皿操作時，應避免反復來回涂，因為感受態(tài)細胞的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。分 子 生 物 學 設 計 性 實 驗 開 題 報 告
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